中医药改善超排卵周期卵泡发育的研究思路

申可佳，尤昭玲

（1.湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中西结合学院，湖南 长沙 410208）

体外受精－胚胎移植（in vitro fertilization embryo transfer, IVF-ET）及其衍生技术是人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology, ART）的主体，是临床治疗不孕不育症的有效手段。决定IVF-ET成功率的主要因素是胚胎质量和子宫内膜容受性。胚胎质量取决于优质的卵子和精子，而IVF- ET中卵子的获得常需使用控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation, COH）方案。COH是指以药物的手段在可控制的范围内诱发多卵泡的发育和成熟，以便获得更多可供移植的胚胎从而提高受孕率。COH应用于IVF-ET 20余年，给众多不育家庭带来了福音，是IVF的关键技术之一。但在临床实践中发现，COH周期在促多卵泡发育的同时并非总能获得理想数量的高质量卵子及胚胎，这是影响IVF-ET临床妊娠率的重要原因[1-3]。导师尤昭玲教授临床诊治不孕症时陆续接诊IVF-ET相关病例近万余人次，根据患者在不同治疗阶段的不同证型，结合IVFET的相关影响因素，中西医汇通，慎思明辨，法古创新，创立了一系列方药及耳穴贴压和药膳饮食疗法，在中、西医妇科学术界产生了较大的影响[4-7]。在导师多年的理论和临床经验指导下，通过分析COH周期对卵泡发育及卵子质量的可能影响，在前人相关的研究基础上，本文以导师经验方为切入点，思考如何深化研究中医药改善超排卵周期卵泡发育及卵子质量的作用机制。

1 COH周期卵泡发育的特点与若干问题

生理状态下，女性进入青春期后，在促性腺激素和其它因素的刺激下，每个性周期有若干个始基卵泡开始生长发育，但其中只有1～2个卵泡被选择、优势化最终发育为成熟卵泡并排出卵子，其余的卵泡则在发育的不同阶段通过细胞凋亡机制自行退化闭锁。而超排卵周期同时诱发多个卵泡的发育和成熟，期望在同一时间点获得多个高质量卵子及可供移植的胚胎，这种打破生理常规的操作依赖于大剂量外源性激素的使用。这些药物在促排卵的同时也带来一系列副作用和并发症，其中对卵泡发育的影响更是辅助生殖领域关注的热点。

对于人类和哺乳动物的相关研究指出[8-16]，辅助生殖技术（ART）子代出生缺陷、低体质量儿、重大畸形的风险较自然妊娠增加，从长期安全性观点来看，超排卵治疗期间各种药物对卵子的影响应该引起人们重视。促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa）和促性腺激素（Gn，即FSH、LH）的使用对卵母细胞的发育起着重要而又复杂的作用。高剂量Gn对卵母细胞正常的减数分裂、表观遗传修饰和发育能力均有不同程度的影响：可增加小鼠卵母细胞纺锤体的缺陷或改变细胞内某些基因的转录和表达，从而增加染色体异常的可能性；可促使某些具有遗传或发育缺陷的卵母细胞继续发育成熟，或使一些没有完全成熟的卵母细胞提前发生减数分裂；可导致卵丘细胞与卵母细胞连接松散，卵母细胞皮质颗粒过早出现；以及超排卵小鼠种植前和种植后胚胎死亡率均增高、胎鼠发育迟延；超排卵和自然周期小鼠胚胎基因组甲基模式有显著不同，等等。在临床工作中，超排卵周期被募集的多个卵母细胞，发育不同步、胞浆成熟难以评价，是全世界ART的一个共同难题。

卵巢内部的细胞及分子构成的局部环境是卵泡发育和卵母细胞成熟的直接且重要的调控因素。多项研究发现[17-23]，与自然周期相比，COH周期卵泡液中有蛋白质的异常表达，这些蛋白质参与卵泡发育及排卵、细胞应激反应、类脂/类固醇代谢等过程，其中包括很多卵巢相关的细胞因子及其受体，如瘦素、激活素、血管内皮因子等，它们的异常表达为进一步探索COH对卵母细胞发育和成熟的影响提供了重要的线索。还有研究指出[24-25]，超排卵周期能引发较高程度的颗粒细胞凋亡，这可能是影响卵子质量和数量的重要原因之一。以及超排卵过程中不同的个体卵巢对外源性促性腺激素有着不同的反应，这直接影响到卵泡发育的多少，并最终影响IVF的累计妊娠率。若个体卵巢反应低下，无论怎样增加COH药物剂量也无法获得数量满意的有效卵子。这种卵巢的低反应性是当今辅助生殖技术领域的一个难题，发生率约9%～24%，至今在西医领域无很好的解决方法[26-28]。

2 中医药改善COH周期卵泡发育的研究思路

用传统的中医理论来看现代医学的超排卵方案，其试图通过药物在一个时间段促使多个卵泡共同发育并在同一时间点成熟，这会造成人体肾精、肝血的相对不足，肾精不足化卵，单个卵细胞得到的精血量少；冲任二脉缺乏肾阴和肝血的充养，无法使多个卵子同步健康地发育成熟。加之患者就诊期间紧张的心理情绪，以及超排卵用药影响机体的内环境等，导致肝气疏泄失调，气机不利，冲任失畅，从而造成生卵、育卵、排卵障碍。若先天禀赋不足，或早婚，或房室不节，或惊恐伤志，或邪气损伤，造成肾的功能失常，致使肾阴阳失衡，生精化气生血功能不足，天癸的产生与分泌失调，冲任失固失养，则种子成孕的功能发生异常，这种情况似与COH周期的卵巢低反应性同属。

现代辅助生殖技术是近20年发展起来的新技术，据文献记载[29-41]，近10年来通过将中医补肾调冲的原理合理应用于ART，能促进卵泡发育及改善卵子质量、提高卵巢反应性、减少促排卵药物用量、改善子宫内膜容受性，进而提高妊娠率，且发现多种作用机制可能参与其中，如调节机体内分泌功能、调节卵巢局部因子的表达等。但目前关于中药辅治ART的研究存在的不足之处为：（1）研究主要集中在对中药作用效果的描述，对作用机制的研究较少及不够深入；（2）临床辨证分型复杂，所用方药多样，重复性及对比性相对较差；（3）对同一方药作用机制的研究不够系统和深入；（4）剂型不统一，水煎汤剂难以在临床推广应用。

尤昭玲教授从事中医和中西医结合妇科临床、教学及科研工作近40年，在妇科疑难病症-不孕不育的治疗上有独特的理论认识和丰富的临床经验。尤教授在长期临床接诊IVF-ET相关失败病例的过程中，分析思考IVF-ET失败的可能原因，探索中医辅助治疗的切入思路、环节和方法，并在临床实践中逐渐完善、总结，形成了中医辅治的理念、目的和相对稳定的治疗思路与方案。护卵汤是尤教授治疗排卵障碍性不孕患者的经验方，将其用于IVF-ET的辅助治疗，能有效改善IVF-ET的成功率，且其为颗粒剂，患者服用方便，故在临床运用中得到了很好的推广。护卵汤全方由熟地黄、生地、沙参、石斛、山药、莲肉、桑葚子、覆盆子、菟丝子、月季花、莲子心、肉苁蓉、甘草组成。该方旨在益肾健脾，暖巢增液，助养泡膜，宣通脉络，促泡速长，顺势而出；滋补肾精，助膜长养。利用护卵汤研究中医药改善COH周期卵泡发育及卵子质量的作用机制，可从以下几个方面去探讨：

（1）众所周知，下丘脑－垂体－卵巢轴的神经内分泌调控与卵泡的发育及卵子的质量密切相关，中药护卵汤是否通过影响COH周期机体的内分泌环境从而改善卵子质量。

（2）卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞（尤其是颗粒细胞）是辅助卵母细胞成熟及排卵的重要且必要的细胞环境，卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞和间质细胞等体细胞与卵母细胞之间存在广泛的相互调节，卵巢体细胞的生长凋亡对于卵泡发育及卵母细胞的质量有着举足轻重的作用。COH周期卵巢颗粒细胞凋亡较自然周期增多，研究护卵汤对COH周期卵巢体细胞凋亡的影响，能有效阐述其影响卵子质量的作用机制。

（3）卵巢内部蛋白构成的卵巢微环境是影响卵泡发育及卵母细胞质量的直接且重要环境。与自然周期相比，已发现COH周期卵巢微环境中部分细胞因子及其受体含量变化，进而影响卵子质量。护卵汤能否改变相关因子的表达从而改善卵泡发育及卵子质量？在IVF-ET的相关文献中，报道过中医药影响卵巢相关因子的表达，但这些研究要么着眼于基因水平，要么多以单个或几个蛋白为研究对象。我们知道，生物功能的实际实施者是蛋白质，且卵巢微环境涉及的蛋白分子众多，卵泡发育/卵母细胞的成熟过程涉及到多种特异的生化、细胞和分子事件，因此仅凭对单个或几个蛋白的研究还远不能揭示中医药对其影响的作用机制。近年来兴起的蛋白质组学研究是对特定细胞、组织或器官所包含的蛋白质的系统研究，是从细胞及整体水平上研究蛋白质的组成及其变化规律。研究的视野不再局限于一两个蛋白质的功能，而是扩展到了成千上万个蛋白质的表现。选用蛋白组学相关技术对护卵汤进行研究，能系统全面地揭示中药对COH周期卵巢微环境的影响。

（4）无论是下丘脑－垂体－卵巢轴分泌的激素，还是卵巢微环境中的蛋白分子，最终均通过细胞信号转导通路实现对卵泡发育的调控。细胞信号转导是非常复杂的过程，涉及胞外配体、跨膜受体、胞内各种信使分子，以及相关靶基因和最终调控的蛋白质产物，且多条通路与卵泡发育及卵母细胞成熟有关。选取相关的通路，研究护卵汤对COH周期卵巢细胞多靶点的影响，最能直观地揭示中药的作用机制。这方面的研究目前没有文献报道。

综上所述，在关于如何深化研究中医药改善COH周期卵泡发育及卵子质量的思考中，笔者认为应从提高临床治疗效果、剂型改革、制定统一的疗效观测指标等方面着手，将中医药辅助ART的研究深入到分子水平，系统全面地揭示其微观机制，用更多科学的数据证实中医药在IVF-ET中的应用价值。

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