茭白胡麻叶斑病病原鉴定及其生物学特性

杨绍丽，吴仁锋，刘义满，柯卫东，钟兰，李建洪

（1.武汉市蔬菜科学研究所，430065；2.华中农业大学植物科学技术学院）

茭白胡麻叶斑病病原鉴定及其生物学特性

杨绍丽1，吴仁锋1，刘义满1，柯卫东1，钟兰1，李建洪2

（1.武汉市蔬菜科学研究所，430065；2.华中农业大学植物科学技术学院）

从国家种质武汉水生蔬菜资源圃茭白田分离出引起胡麻叶斑病的病原真菌，对该菌进行了形态学观察、致病性测定，及其生物学特性研究。结果表明，引起该病的病原菌为Bipolaris zizaniae。其生物学特性研究表明，病菌菌丝最适宜在PDA和PSA培养基上生长，最适宜在燕麦培养基上产孢；菌丝生长的最适温度范围为25～30℃；最适pH值6～8；光照有利于菌丝生长；病菌能够利用多种碳源和氮源，碳源以可溶性淀粉和乳糖利用效果最好，氮源以硝酸钾和硝酸钠利用效果最好；菌丝及分生孢子致死温度为5℃10 min。

茭白；胡麻叶斑病；病原鉴定；生物学特性

2009-2011年，茭白胡麻叶斑病[1]在国家种质武汉水生蔬菜资源圃发生普遍，并且在主产区为害严重，影响茭白的产量和品质，给茭白标准化栽培及茭农生产造成巨大的经济损失[2，3]。为弄清湖北地区茭白胡麻叶斑病病原以及该菌对不同理化环境和营养条件的需求，笔者对其病原进行了鉴定，并对生物学特性进行了较为系统的研究，以期为研究该病害的发生规律和防治技术提供重要理论依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离与培养

病样采自国家种质武汉水生蔬菜资源圃。采用常规组织分离法分离病原菌[4]，获得纯化菌株PDA斜面4℃保存备用。

1.2 致病性测定

采用离体叶片接种法测定病原菌致病性。取健康茭白叶片，经75%酒精表面消毒后用无菌水冲洗干净，吸水纸吸去表面的残留水分，然后平铺于铺三层吸水纸（完全浸润）的瓷盘。在PDA平板上培养5 d的菌落边缘打取直径为6 mm的菌饼，挑取单个菌饼放于叶片中间，菌丝面朝下。以空白琼脂块接种的叶片作对照。保鲜膜密封瓷盘，置于25℃恒温光照箱中培养。接种48 h后移去菌饼，待接种叶片表现症状后对病斑进行组织分离，在显微镜下观察分离到的病菌是否与接种的病菌相同。

1.3 病原菌的鉴定

将分离纯化后得到的单孢菌株于PDA平板中央25℃黑暗培养5 d后观察菌落形态，并挑取菌丝制成玻片在显微镜下观察分生孢子和分生孢子梗形态，测量分生孢子大小。观察菌株产孢表型，方法参照张天宇等[5]的滤纸片法。

1.4 病原菌生物学特性观察

①培养基对菌丝生长及产孢的影响 供试5种培养基：PDA培养基[4]、PSA培养基[4]、查氏培养基[4]、燕麦培养基[4]、蛋白胨培养基[6]。将PDA平板上培养5 d的菌株沿菌落边缘用打孔器打直径6 mm菌饼，分别移置不同培养基平板中央，置于25℃恒温培养箱中培养，每处理3次重复，3 d后按十字交叉法测量菌落的直径，再培养7 d后测定产孢情况。

②光照对菌丝生长的影响 将PDA平板上培养5 d的菌株沿菌落边缘用打孔器打直径6 mm菌饼，接种于PDA平板中央。置于25℃HP250GS智能人工气候培养箱中培养。设连续黑暗、12 h光暗交替、连续光照3个处理（光源为普通日光灯18 W，22 cm），每处理3次重复，3 d后按十字交叉法测量菌落直径。

③温度对菌丝生长的影响 将PDA平板上培养5 d的菌株沿菌落边缘用打孔器打直径6 mm菌饼，接种于PDA平板中央。置5，10，15，20，25，30，35，40℃的恒温培养箱中培养，每处理3次重复，3 d后按十字交叉法测量菌落直径。

④pH值对菌丝生长的影响 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节 PDA培养基的 pH值分别为3，4，5，6，7，8，9，10，11，12。在不同pH值的平板上接种直径为6 mm菌饼，置于25℃恒温培养箱培养，每个处理3次重复，5 d后按十字交叉法测量菌落直径。

⑤碳、氮源对菌丝生长的影响 以Czapek培养基为基础培养基[4]。用含碳量相同的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、可溶性淀粉代替其中的30.0 g蔗糖，以不加碳作对照。用含氮量相同的尿素、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、精氨酸代替其中的2.00 g硝酸钾，以不加氮作对照。打取直径为6 mm的菌饼，接种在不同碳、氮源平板中央，每个处理3次重复。置于25℃恒温培养箱中培养，5 d后按十字交叉法测量菌落直径。

⑥菌丝及孢子致死温度测定 菌丝致死温度测定：将PDA平板上培养5 d的菌株沿菌落边缘用打孔器打直径6 mm菌饼，取菌饼置于无菌试管中，加入2 mL无菌水。分别在35，40，45，50，55，60，70℃水浴锅中处理10 min后取出试管迅速冷却，将菌饼取出置于PDA平板上25℃恒温培养，5 d后观察其生长情况，每个处理5次重复。

分生孢子的致死温度测定：在PDA平板上培养10 d以上，向培养皿中加入10 mL灭菌水制备孢子悬浮液，调节浓度至1.6×10个/mL孢子，移取1 mL孢子悬浮液于1.5 mL Eeppendorf管中，分别置于45，50，55，60，65，70℃水浴锅中处理 10 min后取出迅速冷却。24 h后在显微镜下观察分生孢子萌发情况，统计孢子萌发率（%），每处理5次重复。

2 结果与分析

2.1 病原菌的鉴定

①病原菌形态观察 经PDA培养基培养后，菌落初为灰白色，后期变为墨绿色，气生菌丝致密，绒状，有隔（图1A、1 B、1 C）。25℃黑暗条件下培养10 d后，产生分生孢子。分生孢子以点聚生方式着生于分生孢子梗上（图1D），分生孢子为黄褐色至褐绿色，倒棍棒形，有假隔膜5~8个，表面光滑，脐略突出，大小为（53.7~96.2）μm×（11.0~22.1）μm（图1E）。

②产孢表型观察 保湿培养24 h后在滤纸上可以观察到滤纸孔边缘的薄层菌向中央生长。显微镜下分生孢子以点聚生的方式着生于分生孢子梗上，每个分生孢子梗上着生不同数目的分生孢子，并且可以看到不同成熟度分生孢子上隔膜的变化（图2）。

通过对病原菌菌落形态、分生孢子形态大小、分生孢子梗形态以及产孢表型观察，结合真菌分类检索表及邓晖[7]的分类研究确定该病菌为Bipolaris zizaniae.。

2.2 致病性测定

将室内接种后的茭白叶片置于25℃下生长，48 h后去掉接种的菌饼，这时在叶片上已显现黄褐色病斑，接种后5 d黄褐色病斑更为明显。接种10 d后，病部产生分生孢子。从发病植株上可重新分离得到该病原菌，重新分离到的病原菌的培养性状、分生孢子形态、大小，均与当初接种的相同。根据柯赫氏法则证实Bipolaris zizaniae为致病菌。

2.3 病原菌生物学特性观察

①培养基对菌丝生长的影响 表1及图3表明，在5种培养基上，病原菌均能生长，PDA和PSA上菌丝生长最快，查氏培养基不适合菌丝生长。其中能产孢的培养基有 PDA、PSA、燕麦、查氏，且产孢量依次为燕麦＞PDA≥PSA＞查氏。

②光照对菌丝生长的影响 菌株在PDA平板上连续黑暗、连续光照、12 h光暗交替条件下培养3 d，菌落平均直径分别为48.08，64.50，60.08 mm。光照条件较有利于菌丝的生长。

图1 PDA上的菌落形态以及分生孢子与分生孢子梗形态

③温度对菌丝生长的影响 在 PDA平板上，菌丝在10~35℃下均能生长，适宜温度为25~30℃，最适为30℃，菌丝在5℃和40℃下不能生长（图5）。

④pH值对菌丝生长的影响 由图6可以看出，PDA培养基pH值3～12时，菌株均可生长，以pH值6～8最适，当 pH值为7时，菌丝生长量最大，说明接近中性环境更适宜病原菌生长。

⑤碳、氮源对菌丝生长的影响 从表2可以看出，蔗糖、乳糖等7种碳源均能被利用，其中菌丝在可溶性淀粉中生长最好，其次为乳糖，果糖最差；硝酸钾、尿素等6种氮源均能被利用，其中菌丝生长以硝酸钾利用最好，其次为硝酸钠、硝酸铵，氯化铵最差。在无碳和无氮培养基上该菌也能够生长，但菌落较稀疏。

⑥菌丝及孢子致死温度测定 试验结果表明，水温50℃下处理10 min后，菌丝在PDA培养基上均能再生长，而在55℃水浴处理10 min后，每个重复均无菌丝生长；分生孢子在55℃水浴处理10 min后均不能再萌发，说明55℃的温水处理10 min可杀死菌丝体，抑制孢子萌发。

图2 滤纸片上培养24 h菌株产孢表型观察

表1 茭白胡麻叶斑病菌菌株在各培养基上的培养性状

图3 不同培养基对菌丝生长的影响

图5 不同温度对菌株菌丝生长的影响（3 d）

图4 不同光照对菌丝生长的影响

图6 不同pH值对菌株菌丝生长的影响（5 d）

3 小结与讨论

据笔者调查，武汉茭白胡麻叶斑病在每年5月中下旬，温度在20℃开始有零星发生，随着气温升高病害迅速蔓延，6~7月发生为害最重，这与本试验中菌丝生长适宜温度范围为25~ 30℃，30℃菌丝生长最快的结果基本一致。王建等[8]报道茭白胡麻叶斑病菌菌丝生长和产孢的最适温度都为25℃，而每年7~8月的平均气温为24~ 28℃，湿度大，该病大面积流行和蔓延，这与安徽省岳西县地处大别山区的地理环境相适应。本研究中病原菌能够利用多种碳、氮源，碳源以可溶性淀粉和乳糖利用效果最好，而此研究结果与王建等[8]研究结果较一致。在氮源利用上，硝态氮比其他几种氮的利用效果好且差异显著，表明在各种氮源中病原菌对硝态氮的利用优于氨态氮，可以利用该菌对碳源利用的差异来合理施肥，控制病害的发生。

经病原菌的分离培养、形态学鉴定以及柯赫氏法则的验证，引起湖北茭白胡麻叶斑病的病原为Bipolaris zizaniae，为半知菌亚门长蠕孢属真菌。对病原菌生物学特性研究了解到茭白胡麻叶斑病菌是一种能够以多种碳氮源为营养来源、适宜中性环境、耐高温的病原真菌。本文研究了部分环境因子和营养物质对菌丝生长和产孢的影响，还需进一步研究其他因子如相对湿度等对病菌生长和发育的影响，以及研究分生孢子生物学特性，为了解病菌的侵染和病害流行奠定基础。

表2 不同碳源、氮源对菌株菌丝生长的影响

表3 菌株菌丝生长的致死温度

[1]吕佩珂，苏慧兰，高振江，等．中国现代蔬菜病虫原色图鉴[M]．呼和浩特：远方出版社，2008．

[2]柯卫东．茭白胡麻叶斑病的发生及防治[J]．湖北农业科学，1990（1）：26，33．

[3]叶琪明，顾建国，李建荣，等．茭白锈病和胡麻斑病的发生规律及其无害化防治[J].浙江农业学报，2003，15（3）：144-148．

[4]方中达主编．植病研究方法.3版[M]．北京：中国农业出版社，1998．

[5]张天宇．中国真菌志（第十六卷）链格孢属[M]．北京：科学出版社，2003.

[6]黄思良，赵艳珠，黄连江，等．不同培养基对芒果炭疽病菌分生孢子形成的影响[J].西南农业学报，1998，11（1）：62-66．

[7]邓晖．中国平脐蠕孢属（BipolarisShoemaker）的分类研究．[D]．山东：山东农业大学，2002．

[8]王建，朱世东，袁凌云，等．茭白胡麻斑病菌生物学特性研究[J].中国农学通报，2007，23（11）：279-300．

Etiological and Biological Characteristics of Pathogenic Fungus Causing Brown Spot onZizania latifoliaTurcz.

YANG Shaoli1,WU Renfeng1,LIU Yiman1,KE Weidong1,ZHONG Lan1,LI Jianhong2
(1.Wuhan Vegetable Research Institute,430065;2.College of Plant Science and Technology,Huazhong Agricultural University)

We isolated a pathogen causing brown spot fromZizania latifoliaTurcz.fields in the National Aquatic Vegetables Resources Nursery of Wuhan,and we studied its morphological characteristics,pathogenicity and biological characteristics. The results showed that the pathogen wasBipolaris zizaniae,and PDA and PSA were suitable for mycelial growth,while oats medium was beneficial for producing spores.The optimal temperature for the mycelial growth was 25-30℃,with the optimal pH value of 6-8,and light promoted the growth of mycelial.The pathogen could make use of various carbon and nitrogen sources,and soluble starch,lactose,potassium nitrate and sodium nitrate were best for mycelial growth.The lethal temperature for mycelial growth and spores germination were 55℃for 10 min.

Zizania latifoliaTurcz.;Brown spot;Pathogen identification;Bio1ogical characteristics

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.16.035

国家公益性行业（农业）科研专项（200903017-08）杨绍丽（1981-），女，助理农艺师，硕士，研究方向蔬菜病害诊断及防控，E-mail：yangshaoli0123@163.com

吴仁锋（1973-），通信作者，男，高级农艺师，硕士，主要从事蔬菜病害诊断及综合防控研究，E-mail：wuhanwurenfeng@126.com

2012-07-04