芡种质资源及其杂种后代的初步遗传分析与评价

游永宁，尹渝来，刁英，孙芳芳，郑兴飞，周明全，鲍忠洲，胡中立

（1.武汉大学生命科学学院，430072；2.苏州市蔬菜研究所；3.湖北省莲藕工程技术研究中心）

芡种质资源及其杂种后代的初步遗传分析与评价

游永宁1，尹渝来2，刁英1，孙芳芳2，郑兴飞1，周明全3，鲍忠洲2，胡中立1

（1.武汉大学生命科学学院，430072；2.苏州市蔬菜研究所；3.湖北省莲藕工程技术研究中心）

利用DNA标记（AFLP标记和SRAP标记）研究了11份芡、4份鸡王莲和1份克鲁兹王莲之间的亲缘关系，13对AFLP引物共产生490条条带，多态性条带447条（91.22%）；9对SRAP引物共产生162条条带，多态性条带151条（93.21%）；用UPGMA法建立的分子标记聚类树显示，克鲁兹王莲与其他材料（包括鸡王莲）差异很大，而鸡王莲与芡也有一定的差异。此外，对5份芡杂交材料的品质性状进行了检测，利用品质性状的数据进行聚类分析的结果表明，材料间的遗传距离很近，难以分辨相同种属不同材料的遗传关系和分类地位。

种质资源；芡；克鲁兹王莲；分子标记；品质性状

克鲁兹王莲（Victoria cruziana）是原产于南美洲热带的大型多年生浮叶植物，属睡莲科王莲属[1，2]。因其花和叶外形优美，在我国的南方地区植物园得到广泛种植。芡（Euryale ferox）是大型一年生浮叶植物，多刺，属睡莲科芡属[3]。芡根据其植株形态又分为刺芡和苏芡两种，前者叶片、叶柄、花梗密布刚刺，广布于东南亚及我国南北各省区的池塘和沼泽中，均为野生或半野生种，在江苏、安徽、湖北沿长江一带栽培较多[4，5]；后者原产江苏省苏州市，其植株仅叶片背面叶脉上及叶缘有少量刺，因其产量高、品质糯，现正在全国各地推广种植。芡也为观叶植物，且与克鲁兹王莲同属睡莲科，有可能杂交形成获得集食用和观赏为一体的新品种。

芡是被子植物中的一个古老物种，种子被称为芡实或鸡头米，可供食用，也可入药。芡实含有可溶性糖、脂肪、蛋白质、钙、铁、磷、抗坏血酸、核黄素和树脂等多种有效成分，对多种疾病均具有良好的疗效[6，7]。然而，随着我国农业的发展，野生种群隔离和栖息地等被破坏，导致野生芡品种的种群减少，甚至灭绝。而且，目前对于芡的种群生态学和种群遗传结构的研究还很有限，因此对芡的保护和利用就受到一定限制[8]。

本研究首次利用 DNA标记 （AFLP标记和SRAP标记）对芡、克鲁兹王莲及其杂交材料的种质资源进行研究。同时，还对芡杂交材料的品质性状进行了检测和分析，为芡的育种提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料包括1份克鲁兹王莲叶片样品，11份芡叶片样品，4份鸡王莲叶片样品（克鲁兹王莲与芡的杂交材料，暂定名为鸡王莲）。芡样品包括1份刺芡、3份苏芡、7份芡的杂交材料，具体见表1。为了对芡杂交材料的品质性状进行研究，取其中5个杂交材料（编号分别为10、11、12、14和15）进行品质性状分析。

1.2 基因组DNA提取

采用植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取植物基因组总DNA。

1.3 AFLP分析

①采用EcoRⅠ，MseⅠ对植物基因组总DNA进行双酶切，反应体系：4 μL 10×Buffer（Tango），4 μL DNA（50 ng/μL），0.3 μL EcoRⅠ（10 U/μL），11.4 μL ddH2O。37℃酶切消化3 h，65℃酶切消化3 h。

②采用T4 DNA连接酶对双酶切产物进行连接反应，反应体系：12.5 μL Double digested DNA，2.5 μL 10×Buffer,1.5 μL MseⅠadapters（10 μmol/L），1.5 μL EcoRⅠadapters（10 μmol/L），0.4 μL T4 DNA ligase（5 U/μL），6.6 μL ddH2O。在冰箱中4℃连接反应16 h。此连接产物稀释10倍。所用接头序列为mad5 5'-GAC GAT GAG TCC TGA G-3'，mad3 5'-TAC TCA GGA CTC AT-3'，ead5 5'-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3'，ead3 5'-AAT TGG TAC GCA GTC TAC-3'。

③预扩增反应体系：2 μL MgCl2（20 mmol/L），2.5 μL 10×Buffer，2 μL MC00（10 μmol/L），2 μL EA00（10 μmol/L），2 μL dNTPs（10 mmol/L），1 μL Taq DNAPolymerase（2U/μL），5μLDilutedDNATemplate，8.5 μL ddH2O。反应程序为94℃2 min；进入20个循环，94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min；最后于72℃延伸5 min。

④选择性扩增：取预扩增产物5 μL，加入ddH2O稀释至50 μL，反应体系：2.5 μL 10×Buffer，2 μL MgCl2（20mmol/L），1.2μLdNTPs（10mmol/L），0.5 μL Taq DNA Polymerase（2 U/μL），1 μL MCNN/CMCNN（10 μmol/L），1 μL EANN/ENN （10 μmol/L），1.5 μL Diluted DNA Template，16.3 μL ddH2O。反应程序为94℃5 min；进入10个循环，94℃30 s，65℃1 min（每循环降低0.7℃），72℃ 1 min；再进入30个循环，94℃30 s，56℃1 min，72℃1min；最后于72℃延伸5min。

⑤加入10 μL的变性剂（98%甲酚胺，0.03%溴酚蓝和二甲苯氰），于94℃变性3 min，采用6%的变性聚丙烯凝胶，1×TBE缓冲液，70 W恒功率电泳3 h，银染检测电泳结果。

⑥从30对引物中筛选出13对条带清晰引物，用此13对引物对16个样品进行扩增。

1.4 SRAP分析

①取提取的基因组总DNA 5 μL，加ddH2O稀释至100 μL，反应体系：1.25 μL 10×Buffer（Containing Mg2+），0.6 μL dNTPs（10 mmol/L），0.5 μL Taq DNA Polymerase（2U/μL），0.5μLForwardprimers（10μmol/L），0.5 μL Reverse primers（10 μmol/L），1 μL DNA Template，10.65 μL ddH2O。反应程序为95℃5min；进入5个循环，95℃1min，35℃1 min，72℃1 min；再进入35个循环，95℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min；最后于72℃延伸10 min。

②加入10 μL的变性剂，于94℃变性3 min，采用6%的变性聚丙烯凝胶，1× TBE缓冲液，70 W恒功率电泳3 h，银染检测电泳结果。

③从30对引物中筛选出9对条带清晰引物，用此9对引物对16个样品进行扩增。

1.5 分子标记数据处理与分析

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，有带记为1，无带记为0，缺失记为2。将0，1，2矩阵数据输入电脑，应用UPGMA对试验材料进行聚类分析并采用NTSYSpc（Version 2.02a）软件处理，建立聚类图。

1.6 品质性状测定与分析

对5份芡的杂交材料的品质性状进行了测定，包括维生素C、可溶性糖、淀粉、脂肪、蛋白质、水分、铁、钙、钾的含量。以上检测委托重庆市永川区农产品质量安全检测中心进行。对试验材料进行聚类分析并采用NTSYSpc（Version 2.02a）软件处理，建立聚类图。

表1 本试验所用的16份材料

2 结果与分析

2.1 AFLP分析

13对引物共产生490条清晰条带，447条为多态性条带（91.22%）。

根据这13对多态性引物的扩增结果，对16份材料进行聚类分析（图1），结果如下。

克鲁兹王莲与其他材料 （包括鸡王莲）Jaccard相似系数仅为0.20。芡（包括鸡王莲）材料间的相似系数为0.90~0.99。在相似系数 0.90处分为 2个类群，类群Ⅰ包括大部分材料，类群Ⅱ包括14号一个杂交材料样品。在相似系数为 0.95处分为 3个类群，类群ⅠA包括 2号、3号和4号鸡王莲与9号苏芡，类群ⅠB包括5号鸡王莲与12号、13号杂交材料，类群ⅠC包括6号刺芡，7号、8号苏芡和 10号、11号、15号、16号杂交材料。

从这3类材料的聚类树系图（图2）中可以看出，鸡王莲材料与芡材料的关系更为密切。

2.2 SRAP分析

9对引物共产生 162条清晰条带，151条为多态性条带（93.21%）。

根据这9对多态性引物的扩增结果，对16份材料进行聚类分析（图3），结果如下。

克鲁兹王莲与其他种（包括鸡王莲）的Jaccard相似系数仅为0.38，芡（包括鸡王莲）材料间的相似系数为0.80~0.93。在相似系数0.80处分为2个类群，类群Ⅰ包括大部分材料，类群Ⅱ包括14号一个杂交材料样品。在相似系数为0.85处分为3个类群，类群ⅠA包括2号、3号、4号和5号鸡王莲与8号苏芡，类群ⅠB包括9号、10号、12号和13号杂交材料，类群ⅠC包括6号刺芡，7号苏芡和11号、15号、16号杂交材料。从这3类材料的聚类树系图（图4）中可以看出，鸡王莲材料与芡材料的关系更为密切。

2.3 品质性状分析

对5份芡杂交材料进行品质性状检测（表2）。

由图5可以看出，各杂交材料间的遗传距离为0.01～0.02，在遗传距离0.012处将5个杂交材料分为三大类，即10号杂交材料单独一类，11号和12号杂交材料聚为一类，14号和15号杂交材料聚为一类。这一结果与AFLP和SRAP的结果均不一致。由此可以看出，利用品质性状数据算出的聚类遗传距离很近，难以分辨各杂交材料的遗传和分类地位。

图1 根据AFLP 13对多态性引物扩增结果进行16份材料的聚类树系分析

图2 根据AFLP 13对多态性引物扩增结果进行3类材料的聚类树系分析

图3 根据SRAP 9 对多态性引物扩增结果进行16 份材料的聚类树系分析

图4 根据SRAP 9对多态性引物扩增结果进行3类材料的聚类树系分析

表2 参试材料品质性状检测结果

图5 5份杂交材料品质性状的聚类树系分析

3 小结与讨论

AFLP与SRAP的聚类结果均支持克鲁兹王莲与芡为不同的种，克鲁兹王莲与其他材料（包括鸡王莲）之间的遗传Jaccard相似系数分别仅为0.20和0.38。鸡王莲是苏州市蔬菜研究所创制的新种质，2007年以克鲁兹王莲为父本、紫花苏芡与刺芡杂交F4代为母本杂交后逐年选种，至2011年，杂交后代植株性状除叶片边缘上翘明显如王莲外，其他性状与芡实差异较小。在SRAP的聚类结果中，鸡王莲全部聚在一起，除了8号苏芡外，鸡王莲与其他芡材料均有一定的差别；在AFLP的聚类结果中，大部分鸡王莲（2号，3号，4号）材料与9号苏芡聚为一类，5号鸡王莲与12号、13号芡杂交材料聚为一类。分子标记分析结果说明，通过芡与克鲁兹王莲的杂交，其杂交后代——鸡王莲仍然是芡，但可能获得了克鲁兹王莲的部分遗传物质，而且每个材料所获得的遗传物质多少和类型存在差异，导致在聚类时鸡王莲整体上偏向芡，而又有部分差别。

AFLP和SRAP分析结果显示，种间的遗传相似系数较低，而芡种内材料间的遗传相似系数较高，但是AFLP分析中的种间遗传相似系数比在SRAP分析中更低，而芡种内材料间的系数更高，说明对于芡与克鲁兹王莲而言，AFLP更容易分辨种间的差异，而不容易发现芡种内材料间的差异。SRAP则正好相反，可能是因为AFLP与SRAP在基因组上扩增位置的不同，导致AFLP和SRAP聚类结果略有不同。从品质性状的聚类结果可以看出，这5个芡杂交材料的遗传背景较近，各个材料的营养成分没有很大的差别，聚类结果也与AFLP和SRAP的结果不一致。

目前，鸡王莲选育走两个方向，一是按芡实方向选育芡实新品种，追求果粒大、壳薄、米仁大、产量高；二是按王莲方向选育，翘边明显，观赏为主。

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Genetic Analysis and Evaluation ofEuryale feroxGermplasm Resources and Their Hybrid Progenies

YOU Yongning1,YIN Yulai2,DIAO Ying1,SUN Fangfang2,ZHENG Xingfei1,ZHOU Mingquan3, BAO Zhongzhou2,HU Zhongli1
(1.College of Life Sciences,Wuhan University,430072; 2.Suzhou Vegetable Research Institute;3.Hubei Lotus Engineering Technology Research Center)

In this research,two DNA molecular markers AFLP and SRAP were used to study genetic relationships of elevenEuryale feroxresources withVictoria cruzianaand four hybrids ofV.cruzianaandE.ferox.Thirteen pairs of AFLP primers showed 490 bands,including 447 polymorphic bands (91.22%),and nine pairs of SRAP primers showed 162 bands,including 151 polymorphic bands(93.21%).The clustering tree showed thatV.cruzianaclearly separated with other fifteen samples and there also had some differences between the elevenE.feroxsamples and the four hybrids.At the same time,fiveE.feroxsamples were provided to take the quality testing,and the cluster analysis was carried out on the basis of these data.The results showed that genetic distances among the materials were very near,and the nutrient variations were difficult to be used to distinguish the genetic and taxonomic status of the materials.

Germplasm resources;Euryale ferox;Victoria cruziana;Molecular markers;Quality properties

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.16.008

江苏省苏州市科技计划项目“苏州几种特色水生蔬菜种质资源评价与利用”（YJG0909）

游永宁（1986－），男，博士研究生，主要从事植物遗传学、植物种质资源与生物技术研究

鲍忠洲，通信作者，E-mail：baozz1942@163.com

2012-06-30