组织工程构建人工心脏瓣膜的研究进展

马 浩，石海燕，张 晓 综述 王 奇 审校

心脏瓣膜病是危及人类健康的一种常见疾病，人工瓣膜置换术是其主要治疗方法。目前临床应用的人工瓣膜分为机械瓣和生物瓣两种，均可有效改善血流动力学，但非生长性瓣膜［1］。组织工程化心脏瓣膜(tissue－engineering heart valve，TEHV)是利用组织工程技术将受体细胞种植于支架上所构建的一种人工瓣膜，其结构和功能与正常瓣膜相似，具有可生长性和自我修复能力，理论上能克服机械瓣和生物瓣的不足。构建TEHV 的基本思路:采用人工合成材料或同种/异种的脱细胞心脏瓣膜作为支架，将体外扩增的自体活细胞种植于支架上，细胞黏附生长并分化，使其具备正常瓣膜组织的新陈代谢功能，从而应用于临床。因此，TEHV 的研究包括瓣膜支架的制备、种子细胞的选择与培养、细胞种植与体外预适应。近年来随着组织工程技术的发展，TEHV 的研究取得一定进展。

1 瓣膜支架的制备

瓣膜支架是构建TEHV 的基础，理想的瓣膜支架做为细胞贴附生长的模板，不仅要提供足够的机械强度，以承受血流冲击所产生的张力和剪切力，同时又要求提供种子细胞的生长空间和微环境。因此，瓣膜支架应具备以下特性［2］:(1)足够的力学强度，为新生组织提供支撑，直至新生组织具备自身力学特性;(2)良好的生物相容性，无明显的致炎性、免疫原性和细胞毒性;(3)良好的材料－细胞界面，利于种子细胞黏附和增殖;(4)三维多孔立体结构，为种子细胞提供生长空间和微环境;(5)良好的可降解性，植入体内后的降解速度应与细胞的生长速度相匹配;(6)易于消毒。目前研究的瓣膜支架有3 种:人工高分子支架、天然高分子支架和经脱细胞处理后的生物源性瓣膜支架［3］。

1.1 人工高分子支架 根据TEHV 支架的要求，可降解材料无疑是最好的材料。目前常用的有聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)及二者的共聚物(PLGA)等。PGA 易于吸收降解，做为细胞支架被广泛应用于组织工程中，但PGA 缺乏结构稳定性，在组织培养中降解快，较难维持预先设计的形状，而PLA、PLGA 吸收相对较慢，稳定性相对较好，因此将PLA/PLGA 和PGA 按一定比例混合，能更好地控制降解速率和保持预设形状。此类支架的缺点有［3，4］:(1)缺乏细胞识别位点，影响种子细胞的黏附，细胞易于脱落。为增强细胞黏附，目前发展了多种修饰技术以改善其表面特性，包括在材料表面包埋富含精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸序列的细胞外基质成份，用氢氧化钠处理或乙醇和水两步预湿等。(2)机械强度不足。单纯PGA 无纺网不具备良好的抗压强度，通过PLA 包埋或热处理可改善其机械强度，但仍存在抗压强度不足的缺陷。(3)降解产物的致炎性。目前认为高分子支架植入体内后可导致无菌性炎性反应，这与酸性降解产物引起局部PH 值下降有关，有学者将碱性物质引入聚合物中以预防其发生。

1.2 天然高分子支架 天然高分子材料包括胶原蛋白、海藻酸酸盐、透明质酸等。文献［5］报道使用纤维蛋白凝胶做为细胞支架，可以构建完全自体来源的人工瓣膜。其特点:瓣膜结构完全来自自体，降解速度可调节，细胞扩散更均匀等。此类支架包含生物活性物质，利于细胞增殖;但生物力学性能较差，可塑性不强，不具备组织培养的立体结构，来源有限、加工困难，限制了其实际应用。

1.3 生物源性瓣膜支架 生物源性瓣膜支架采用同种异体或异种心脏瓣膜，通过脱细胞处理消除免疫原性，并保持正常瓣膜的三维空间，既有较好的抗张强度，又能提供细胞外基质。细胞外基质由胶原、黏多糖和透明质酸组成，为细胞生长提供了微环境，与种子细胞相互作用，调节各种细胞因子和生长因子的活性，间接激活细胞间的信号传递，促进种子细胞黏附、迁移、生长和分化［6，7］。目前此类支架在构建TEHV 的研究中得到越来越多的关注。

此类支架有同种和异种两类。同种支架是将同种异体细胞脱去后种植受体细胞，可有效抑制免疫反应，减慢瓣膜衰败过程，生物学和力学特性稳定［8］。但因同种支架取材受限，目前研究多限于肺动脉瓣，异种支架应更具研究前景。异种支架的优点是可降低因细胞碎片而引发的瓣膜钙化和衰败，同时细胞黏附率也高于人工高分子支架。目前研究最多的异种支架是经过脱细胞处理的猪主动脉瓣，在解剖形态、组织结构、组成成份和机械强度等方面和人类瓣膜相近，且来源充足。Kasimir 等［9］体外分别种植内皮细胞和间质细胞，结果显示此种支架有良好的生物相容性。但Hopkins等［10］认为其易于传染种间细菌和病毒。由于缺乏长期大规模动物实验，目前很难评价它与高分子支架之间的优劣。

脱细胞方法包括机械法、去污剂法和酶消化法［11］，并结合渗透溶液法进行辅助。常用去污剂有Triton X－100(聚乙二醇辛基苯基醚)、SDS(十二烷基硫酸钠)和SD(脱氧胆酯酸钠)，处理后的组织成份为胶原、弹性蛋白、纤维黏连蛋白和层黏连蛋白。常用消化酶为胰蛋白酶，处理后的组织成份为弹性蛋白、胶原和糖性蛋白。此外，在上述脱细胞基础上使用核酸酶水解细胞内的DNA 和RNA，可以减少或消除猪内源性逆转录病毒的污染［12］。

2 种子细胞的选择和培养

种子细胞是构建TEHV 的关键，理想的种子细胞应具备:(1)取材简便;(2)体外增殖能力强;(3)能适应支架环境;(4)可通过分子生物学技术进行基因修饰。目前常用的种子细胞有:自体组织细胞、成体干细胞、胚胎干细胞和其他细胞等。早期多采用自体细胞，但受其取材限制，干细胞作为种子细胞的研究逐渐深入。

2.1 自体组织细胞 自体组织细胞包括:血管内皮细胞、血管或皮肤的成纤维细胞或肌成纤维细胞等。从理论上看，大动脉的结构、功能与心脏瓣膜有一定的相似性，因而动脉血管壁细胞较符合构建TEHV 的要求，但动脉血管取材有限、创伤大;静脉血管易于获取且安全，胶原产生能力高于动脉血管细胞，目前已有静脉内皮细胞构建TEHV 的少量报道［13］。自体组织细胞做为种子细胞也有一定的缺点，组织细胞属于终末细胞，体外扩增能力较弱，需要牺牲大量血管才能获得足够细胞，其应用受到限制。

2.2 成体干细胞 成体干细胞具有自我更新和多向分化能力，有可能成为理想的组织工程种子细胞，并最终利用成体干细胞构建出完全意义上的TEHV。目前间充质干细胞研究最多。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是中胚层发育的具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，易于获取和分离，体外培养和增殖后多向分化潜能并不减弱，传代后的纯度可达95%以上［14］，是较为理想的TEHV 种子细胞。成人骨髓中BMMSCs 含量较少，每1 ×105的单个核细胞中有2 ～5 个BMMSCs［15］，需体外纯化和扩增，方法有:全骨髓培养法、贴壁筛选法、免疫磁珠法和密度梯度离心法［16］。提取的BMMSCs 在诱导因子作用下能分化成骨骼、平滑肌、心肌和血管内皮等多种组织细胞。Potapova 等［17］指出血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是诱导BMMSCs 分化为内皮细胞的关键。BMMSCs 在改良Eagle's 细胞培养液(dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)+胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的培养液中部分表达成纤维细胞和肌成纤维细胞的重要标志物波形蛋白和α－肌动蛋白，表明BMMSCs 有可能自然分化为成纤维细胞，但BMMSCs 在普通培养环境中是否能够完全分化为成纤维细胞，目前缺乏相关研究。

2.3 胚胎干细胞 胚胎干细胞来源于囊胚的内细胞团，可持续增殖而不分化，经诱导后具备分化形成各类细胞的潜能。在合适的体外培养条件下，胚胎干细胞能分化为内皮细胞和肌成纤维细胞，Tutter 等［18］将人的胚胎干细胞种植在鼠胚成纤维细胞饲养层上，胚胎干细胞自动分化为血管内皮细胞。但目前尚不能建立无免疫原性的人胚胎干细胞系，更重要的是其研究亦受到伦理制约。

2.4 其他细胞 内皮前体细胞(endothelial precursor cell，EPC):存在于成人骨髓及外周血中，由CD34+造血干细胞定向分化而来，VEGF 是CD34 +定向分化为EPC 的关键［19］。在体外可诱导形成内皮细胞，并稳定传代30 代以上，表明EPC 可做为构建TEHV 内皮层的种子细胞。

脐血细胞:Schmidt 等［20］将脐血细胞种植于人工高分子支架后置入生物反应器中培养，结果显示培育的组织具有内皮功能并能产生细胞外基质。这表明脐血细胞可以是一个新的TEHV 种子细胞来源。目前利用EPC 和人脐血细胞做为构建TEHV 种子细胞的研究报道较少，尚无法评价其做为TEHV 种子细胞来源的可行性。

3 细胞种植与体外预适应

种子细胞在瓣膜支架上的种植受到多种因素的影响，如细胞密度、支架表面修饰、种植时间间隔、种植方式和环境等。

3.1 细胞种植 细胞在三维结构上的分布和黏附受限于细胞重力因素，未黏附细胞会迅速脱落。提高种子细胞数量有助于细胞黏附，细胞密度多在105～106/cm2。间隔24 ～36 h重复种植明显优于间隔2 ～12 h 种植。

细胞与支架黏附主要由黏附因子和细胞外基质分子相互作用介导，基质分子包括胶原、纤维黏连蛋白(Fn)和层黏连蛋白(Ln)等。目前用Fn 和Ln 等包被支架已成为提高细胞黏附的重要手段，也可在支架表面进行固定氨基酸、多肽类物质或细胞因子的改性处理，以提高种植效率。

细胞种植的方法有单层种植和复合种植、二维培养和三维培养、静态培养和动态培养等。单层种植是将单类种子细胞种植在支架上，目前构建TEHV 的研究绝大多数集中在内皮细胞、成纤维细胞或干细胞等的单层种植上，但瓣膜组织是由内皮细胞、间质细胞(主要是成纤维细胞)和细胞外基质组成，并在此基础上发挥生理功能，因此多种细胞复合种植于支架表面上应该是构建TEHV 的方向。复合种植分为分层种植和混合种植，前者按照瓣膜组织结构先种植成纤维细胞、后种植内皮细胞，后者是将这两种细胞混合种植，细胞在支架内迁移、重新整合成接近正常的组织结构。目前复合种植在组织工程化人工血管和真皮的研究中取得了一定进展［21，22］，但在构建TEHV 的研究中尚缺乏报道。

二维培养是将细胞置于膜性支架上，细胞形成薄层培养物，但长时间培养细胞会老化，不能构建具有三维结构和功能的TEHV。三维培养是将细胞种植于具有一定空间结构的支架上，细胞在模拟体内细胞的微环境中生长分化，其黏附性和生物活性明显优于二维培养。但种子细胞如何在具有空间结构的支架表面均匀分布是目前尚待解决的问题。

目前细胞培养大多采用静态的方法，由于没有承受脉冲血流的剪切力作用，离体培养时间越长，细胞分化能力越差。Flanagan 等［23］研究发现在剪切应力作用下培养的血管内皮细胞中出现应力纤维，其走向与细胞长轴一致。目前认为，应力环境是细胞生长和维持正常功能的一个重要因素，据此提出了动态培养的方法，并设计了生物反应器，为细胞生长提供旋转、震荡甚至类似体内血流的脉冲应力环境，种植后的细胞能更好地分化并维持正常生理功能。

3.2 体外预适应 研究发现体外培养的内皮细胞黏附力低，在体动物实验中细胞易于脱落，其生理功能与正常细胞相比明显不足，构建的TEHV 不能达到正常瓣膜的性能要求。目前绝大多数研究者认为血流动力学环境对内皮细胞生物学特性和生理功能的形成至关重要，可以促进细胞增殖并增强内皮细胞和成纤维细胞的粘附能力、轴向性生长及胶原产生能力等生物学特性。因此体外构建的TEHV 在植入体内之前必须经过模拟体内环境的预适应，能明显改善细胞黏附力和瓣膜生物学特性［24］。理想的脉动生物反应器应具备以下条件［25］:从生物学角度要保证细胞的生长和代谢，材料无毒，系统密闭，恒温无菌;从流体力学角度要模拟体内血流搏动，脉冲驱动，频率、压力和流量能逐渐上调。为模拟体内血流的脉动，学者们进行了大量的研究，Jansson 等［26］利用钟摆原理设计了应力培养系统，瓣膜随钟摆在培养液里往复摆动，承受类似脉动流的应力。Lichtenberg 等［27］在瓣膜支架上种植体外培养的内皮细胞，置入生物反应器中培养8 天后观察，结果显示培养的细胞具有分层定向能力，细胞的增殖情况也好于非生物反应器培养条件下的细胞。但如何保证稳定的脉冲应力仍是目前研制生物反应器的关键和难点［28］。

4 TEHV 的体内验证

经过体外培育和预适应的TEHV 需移植入体内进一步观察，以评估其各方面性能。目前TEHV 的在体实验研究多集中于动物实验阶段，短期效果良好，但远期效果如机械性、抗血栓、抗钙化和耐久性等尚待进一步研究。TEHV 植入动物体内3 ～6 个月后出现由中性粒细胞和巨噬细胞介导的瓣膜衰坏，但迄今为止仅少数病例应用TEHV 于临床，无法得知植入体内后TEHV 的组织学结构，TEHV 距离实际应用尚有很长的研究历程。

TEHV 作为瓣膜外科领域研究的课题，已经取得了相当大的进展，使我们看到了临床应用的曙光。但这一新兴技术仍处于探索阶段，距离实际应用尚待解决许多技术问题，例如(1)如何完全消除瓣膜支架的免疫原性及其降解产物的致炎性;(2)在使用脱细胞瓣膜支架中寻找更为简单有效的脱细胞方法;(3)短期内如何获得大量种子细胞;(4)采用何种种植方式以提高细胞贴附;(5)研制更为接近体内血流环境的脉冲生物反应器等。这些都要求我们在细胞生物学、分子生物学、血流动力学、材料力学等领域做出更为深入细致的研究。

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