ERK信号通路在檞皮素促大鼠MSCs成骨分化中的作用*

奉水旺， 杨 丽， 王攀攀， 李淑琴， 汪 甜， 尹素娟， 张荣华△

(暨南大学1药学院中药学教研室，2医学院，广东广州510632)

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，通过迁移、增殖、分化，在骨吸收部位形成成骨细胞(osteoblast，OB)，并介导新骨组织形成的过程，也是骨形成的核心过程［1］。目前对MSCs的成骨分化和骨形成的分子机制认识有限，给骨代谢疾病如骨质疏松(osteoprosis，OP)的治疗带来局限。近年来研究发现，细胞外信号调节激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)信号在MSCs成骨分化中发挥了重要作用［2］。实验发现槲皮素(quercetin，QUE)可以抑制去势小鼠骨量丢失而对子宫没有不利影响，但其作用机制还不明确［3］。本实验通过研究QUE是否能促进MSCs成骨，并探索ERK信号通路是否在此过程中发挥重要作用，以期阐明QUE保护骨量的细胞分子生物学机制，为QUE应用于OP等骨代谢疾病的预防和治疗提供细胞分子生物学依据。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 SPF级3月龄雌性Sprague－Dawley (SD)大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK粤2006－0015。MSCs由大鼠股骨和胫骨中分离提取，传至第3代后进行实验。

1.2 主要试剂 Alpha－modified minimum essential medium(α－MEM)购于HyClone;优级胎牛血清购于天津灏洋生物制品科技有限责任公司;QUE购于中国药品生物制品检定所;PD98059购于Millipore;噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物科技公司;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所;酶联免疫吸附测定(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购于RB公司;甘油醛－3－磷酸脱氢酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗大鼠Ⅰ抗、ERK1/2和p－ERK1/2兔抗大鼠Ⅰ抗及羊抗兔Ⅱ抗购于Cell Signaling;SYBR Green PCR Master Mix购于Toyobo。

2 方法

2.1 MSCs的提取 大鼠颈椎脱臼处死，75% 乙醇浸泡10 min;分离双侧下肢，取出股骨和胫骨，去尽表面肌肉以及骨膜;将取出的股骨和胫骨移至超净工作台，用75% 乙醇泡10～30 s，D－Hanks液冲洗5～8次;剪去骨两干骺端，用5 mL注射器吸取含10%FBS的α－MEM完全培养液反复冲洗骨髓腔;用1 mL注射器4×13 TW LB针头反复吹打，使细胞成单细胞悬液，调整细胞密度为1.0×109cells/L，接种到25 cm2培养瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后半量换液，48 h后全量换液，以后每隔3 d换1次培养液。3代以后的细胞用于实验。

2.2 MTT法检测QUE对MSCs的增殖作用 细胞传到第3代用0.25% 胰蛋白酶消化、重悬，以5.0× 106cells/L密度接种于96孔板中。在37℃，5% CO2培养箱内培养到细胞达80% 融合时，设置含QUE 0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L的给药浓度组以及空白组，每组6个复孔。加入无血清的MEM/α培养液培养24 h后，分别加入上述药物浓度的MEM/α完全培养液，培养24 h后，弃去培养液，加入5 g/L MTT溶液20 μL，37℃、5%CO2培养箱内继续培养4 h后，弃MTT溶液，加100 μL DMSO，振荡10 min，使结晶完全溶解，酶标仪490 nm波长检测吸光度(A)。

2.3 ALP测定试剂盒检测不同浓度QUE对MSCs的ALP活性的影响 以1.0×108cells/L细胞密度接种于6孔板中，在37℃、5%CO2培养箱内培养到细胞达80% 融合时，按上述实验分组设置，每组6个孔。加入无血清的α－MEM培养液培养24 h后，分别加入上述药物浓度的α－MEM完全培养液，培养72 h后，吸弃孔中的培养液，用D－Hanks液洗2～3遍，每孔加入细胞裂解液1 mL，4℃作用30 min，收集细胞裂解液。BCA法检测各组的总蛋白浓度，用ALP检测试剂盒检测各组ALP表达。

2.4 分组及干预方法 将细胞以1.0×108cells/L的细胞密度接种于6个60 mm培养皿中，将其设置为空白对照组、QUE组、QUE+PD98059组和PD98059组。细胞无血清α－MEM培养液培养24 h后，需加抑制剂的组先加入抑制剂30 min后，再加入QUE，使各抑制剂最终浓度PD98059为10 μmol/L，QUE的最终浓度为10 μmol/L。

2.5 检测各组ALP、Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ，ColⅠ)和骨钙素(bone Gla protein，BGP)表达 按2.4方法操作后共同培养72 h，弃去培养液，用 DHanks液洗涤3次，加入150 μL细胞裂解液，收集细胞裂解液。用BCA法测定各组的总蛋白浓度，用ALP检测试剂盒检测各组ALP表达，ELISA法检测各组ColⅠ和BGP表达。

2.6 Western botting检测ERK1/2及其磷酸化蛋白的表达 按2.4方法操作后共同培养24 h，弃去培养液，用D－Hanks液洗涤3次，加入100 μL细胞裂解液，收集细胞裂解液。用BCA法检测各组总蛋白浓度，12%SDS－PAGE凝胶进行电泳分离，每组上样总蛋白量30 μg，转膜，封闭，加Ⅰ抗、辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗，用ECL液进行荧光显影并显示在X光片上，结果用Quantity One Manual图像分析软件测定各条带的灰度并进行分析。

2.7 荧光定量PCR检测转化生长因子 β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)、骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP－2)和核心结合因子α1 (core binding factor α1，Cbfα1)mRNA的表达 设计18S、TGF－β1、BMP－2和Cbfα1的荧光定量PCR引物(序列见表1)。按2.4方法分组后共同培养24 h，Trizol提取总RNA，取1 μg总RNA合成cDNA，然后以cDNA为模板，进行上述各基因的荧光定量PCR反应。反应体系包括:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL;cDNA 5 μL;上、下游引物各0.5 μL; dH2O 4 μL。反应在 ABI PRISM® 7500 Sequence Detection System上进行，运行条件为:先95℃ 5 min，然后95℃ 15 s，60℃15 s，72℃ 32 s，共40个循环，在每个循环的第2步结束后收集荧光信号，以荧光信号对反应循环数作图。每个反应设3个复孔，取平均值Ct，通过ΔΔCt法计算各组细胞的上述基因的表达水平。

表1 荧光定量PCR的引物序列Table 1 .The primer sequences for fluorescence quantitative PCR

3 统计学处理

数据采用SPSS 16.0统计软件分析处理，计量资料的数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 QUE对MSCs的增殖和ALP表达的影响

MTT结果显示，10 μmol/L组、1 μmol/L组和0.1 μmol/L组A值显著高于空白组(P＜0.05)，但10 μmol/L组、1 μmol/L组和0.1 μmol/L组之间A值无显著差异(P＞0.05);ALP表达结果显示，10 μmol/L组ALP表达显著高于其它各组(P＜0.05)。因此，10 μmol/L QUE具有最佳促MSCs骨向分化的作用，见表2。

表2 不同QUE浓度对MSCs的增殖和ALP表达的影响Table 2 .Effects of different concentrations of QUE on the proliferation and ALP expression of MSCs(±s.n=6)

表2 不同QUE浓度对MSCs的增殖和ALP表达的影响Table 2 .Effects of different concentrations of QUE on the proliferation and ALP expression of MSCs(±s.n=6)

*P＜0.05 vs 0 μmol/L.

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2 对MSCs干预后ALP、BGP和ColⅠ表达的结果

QUE组ALP、BGP和ColⅠ表达高于空白组(P＜0.01)，QUE+PD98059组ALP、BGP和ColⅠ表达低于QUE组(P＜0.01)，QUE+PD98059组ALP、BGP和ColⅠ表达高于PD98059组(P＜0.01)，见表3。

表3 实验各组ALP、ColⅠ和BGP表达Table 3 .Effects of ERK signaling on ALP，BGP and ColⅠexpression in MSCs(±s.n=3)

表3 实验各组ALP、ColⅠ和BGP表达Table 3 .Effects of ERK signaling on ALP，BGP and ColⅠexpression in MSCs(±s.n=3)

＊＊P＜0.01 vs control group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs QUE group.

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3 磷酸化ERK1/2表达的检测结果

与空白组比较，QUE组磷酸化ERK1/2表达增加(P＜0.05);与QUE组比较，QUE+PD98059组和PD98059组磷酸化ERK1/2表达减少(P＜0.05)，见图1。

Figure 1.Phosphorylation of ERK1/2 in QUE－treated MSCs analyzed by Western blotting.图1 Western blotting检测磷酸化ERK1/2的表达

4 TGF－β1、BMP－2和Cbfα1 mRNA表达的检测结果

与空白组比较，QUE组BMP－2和Cbfα1的表达均增加(P＜0.01)，TGF－β1表达也增加(P＜0.05);与QUE组比，QUE+PD98059组和PD98059组BMP－2和Cbfα1的表达下降(P＜0.01)，TGF－β1表达也下降(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.The expression of TGF－β1，BMP－2 and Cbfα1 mRNA in QUE or/and PD98059－treated MSCs.±s.n =3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs QUE group.图2 TGF－β1、BMP－2和Cbfα1 mRNA的表达

讨论

近年来研究发现，MSCs成骨分化能力减弱而成脂分化能力增强是OP发生的重要机制之一［3］，因此对MSCs成骨分化能力调节的研究成为OP治疗机制研究的热点。现有研究表明，QUE可以抑制去势小鼠骨量丢失而对子宫没有不利影响，但其作用机制的研究还不明确，尤其在它对MSCs是否有作用，如何作用方面还没有报道［4］。因此，本实验从QUE是否能促进MSCs成骨分化入手，并深入探索ERK信号通路是否在此过程发挥作用。

MSCs在成骨分化过程中的不同阶段会表达各种骨特征标志蛋白，如ALP和ColⅠ在成骨分化早期表达高，发生矿化后有所降低，随后是基质蛋白，如:骨桥蛋白和骨涎蛋白，最后同时出现BGP和细胞外基质钙化。这些基质蛋白的协同作用，保证了细胞外基质的成熟，伴随着外基质的成熟，OB被包埋其中而形成骨组织［5］。因此，本实验通过检测ALP成骨特异性指标，来评价不同浓度QUE促进MSCs骨向分化能力;同时以ERK1/2的磷酸化对ALP、ColⅠ和BGP蛋白的影响，来评价ERK信号通路在QUE促进MSCs成骨分化过程可能起到的作用。本实验对不同浓度QUE进行筛选，实验结果提示，10 μmol/ L QUE具有最佳促MSCs骨向分化作用，并能促进MSCs的增殖。

ERK通路是有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)系统中主要的通路。MAPK具有显著的进化保守三级激酶级联形式的特点:细胞受刺激后激活MAPK激酶的激酶(MAP kinase kinase kinase，MKKK)，进而激活MAPK激酶(MAP kinase kinase，MKK)，MKK激活后通过双位点磷酸化调控MAPK的活性。ERK通路是MAPK系统主要和经典的通路:细胞外信号→细胞受体→细胞内酪氨酸激酶和适配蛋白→Ras→Raf→MEKK1→MEK1→ERK1/2→转录因子→细胞增殖、转化相关基因表达→细胞增生、转化。许多研究证明［6－7］，ERK在MSCs成骨分化中起到重要的调节作用。BMPs是属于TGF－β超家族的成员之一，因其能促进OB、成软骨细胞的分化和诱导异位骨形成而得名。研究表明BMP－2和TGF－β1在MSCs成骨分化中能起到十分重要的作用［8－9］。Cbfα1是成骨特异性转录因子又称Runx2［10］。Shi等［11］通过实验证明，间歇性拉伸载荷刺激 MSCs骨向分化是通过RhoA－ERK1/2通路调制Cbfα1变化起作用的，因此Cbfα1作为ERK通路促进MSCs成骨分化的下游转录因子，可作为判断ERK通路是否激活的重要指标。我们在实验中加入QUE，磷酸化的ERK1/2增加，同时Cbfα1表达增加;PD98059抑制ERK1/2后加入QUE，磷酸化的ERK1/2减少，同时Cbfα1表达减少;结果表明，QUE能激活ERK通路。实验中在加入或不加入 ERK1/2的抑制 PD98059情况下，BMP－2和TGF－β1表达随之改变，说明BMP－2和TGF－β1与ERK通路有重要的联系，那么它们之间有着怎么样的联系呢?

有研究表明［12］，在大豆黄酮促进成人干细胞增殖实验中发现ERK依赖TGF－β1的调节;然而也有报道用药物阻断Ras/MEK/ERK后［13］，TGF－β1表达同时受到抑制。本研究发现，QUE在诱导MSCs成骨的过程中，成骨分化相关指标表达增加，同时伴随BMP－2和TGF－β1表达增加;用PD98059抑制ERK1/2后，成骨分化相关指标表达下降，同时BMP－2和TGF－β1表达也降低;有许多研究已经证明ERK通路能介导 Cbfα1的表达［14］，TGF－β/BMPs通路也能调节Cbfα1［15］。因此，QUE在促进MSCs成骨过程中，激活了ERK通路，激活的ERK通路对TGF－β1和BMP－2有调节作用，在ERK通路与TGF－β/BMPs通路之间的交互作用下，共同调节成骨转录因子Cbfα1，从而调节成骨分化;从ERK通路的激活到促进BMP－2和TGF－β1的生成从而增强对Cbfα1调节作用，这一过程将QUE促进MSCs成骨的作用放大。

综上所述，一定浓度的QUE能促进MSCs的增殖和成骨分化，ERK信号的激活在QUE促进MSCs成骨过程中起到十分重要的作用。

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