神经生长因子对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护

汪志峰,张 毅,马宝君,虞 昊

(南通大学第二附属医院,1.神经外科;2.心胸外科,江苏南通,226001)

神经生长因子(NGF)是人类发现的第一个神经营养因子家族成员,也是最重要的一个因子,其在神经细胞体外培养模型中能提高培养神经元的活性,表现出良好的保护受损神经元,促进神经元生长的作用[1]。本研究通过观察NGF对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后氧自由基、炎性细胞因子和神经元凋亡的影响,研究NGF对脑缺血后的神经保护作用机制,为进一步应用于临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性清洁级SD大鼠共36只,体重250～300g,由南通大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2001-0011。凯基原位末端标记(TUNEL)细胞凋亡原位检测试剂盒(BIOTIN标记POD法,石蜡切片专用);考马氏亮兰蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所);超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所);双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组:36只大鼠随机分成3组,即假手术(Sham)组、缺血再灌注损伤(IR)组、NGF治疗组,每组12只。Sham组:麻醉及手术同IR组,只暴露右侧颈总动脉而不做其他操作; IR组:阻断右侧大脑中动脉120 min后开放,不做其他操作;NGF组:同样阻断大脑中动脉120 min,然后在开放的即刻肌注NGF 1 000 U(2 mL生理盐水溶解),假手术组和脑缺血组肌注等量生理盐水。

1.2.2 实验动物模型制作:参考Longa线栓法[2]制作大鼠右侧大脑中动脉可逆性闭塞模型。采用动物的神经功能缺损评分(NDS)作为模型成功与否标准。大鼠麻醉完全清醒后,于再灌注2 h时进行NDS。评分为0分和4分的大鼠予以剔除。保证每组12只不变,随机补充。

1.3 观察指标

再灌注24 h后,从各组大鼠中随机取6只,切取右侧大脑半球,制成10%脑组织匀浆,3 000 r/min低温离心10 min,取上清液测定蛋白含量。参照试剂盒说明行肿瘤坏死因子－ α(TNF－ α)、白介素－1β(IL－1β)、IL－6、SOD、MDA的测定。恢复再灌注24 h后,每组剩余6只大鼠,切取前联合水平冠状面厚约2 mm脑片组织,制成石蜡切片,用TUNEL法检测凋亡神经细胞。检测程序按试剂盒操作说明进行。

2 结 果

2.1 大鼠脑组织匀浆中SOD和MDA的变化

SOD活性在 IR组最低,Sham组最高。与IR组相比,NGF组SOD活性明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。MDA含量检测发现,再灌注24 h脑组织均浆中MDA含量在IR组最高, Sham组最低。与IR组相比,NGF组MDA含量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 大鼠脑组织中SOD、MDA的变化(±s)

表1 大鼠脑组织中SOD、MDA的变化(±s)

组别 n SOD(nU/mL) MDA(nmol/mL) Sham组 6 207.93±15.09 0.91±0.18 IR组 6 126.94±8.61 2.72±0.39 NGF组 6 157.05±10.4433 1.86±0.2933

2.2 大鼠脑组织均浆中TNF －α、IL－1β、IL－6的变化

再灌注24 h脑组织均浆中TNF－ α、IL－1β、IL－ 6在IR组均最高,Sham均最低。与 IR组相比, NGF组TNF－a、IL－lβ水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与IR组相比,NGF组IL－6水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表1 大鼠脑组织中TNF－ α、IL－lβ、IL－6、凋亡细胞数的变化(±s)

表1 大鼠脑组织中TNF－ α、IL－lβ、IL－6、凋亡细胞数的变化(±s)

与IR组比较,3P<0.05,33P<0.01

组别 n TNF－ α(ng/mL) IL－1β(ng/mL) IL－6(pg/mL) 凋亡细胞数(个/400倍) Sham组 6 0.61±0.12 100.15±12.20 63.48±8.84 3.13±0.56 IR组 6 1.28±0.27 170.56±18.18 121.63±13.03 51.98±4.13 NGF组 6 0.97±0.173 147.86±14.603 98.57±11.0833 41.91±5.7133

3 讨 论

NGF是机体产生的能够促进神经细胞存活、生长、分化的一种多肽。它不仅具有中枢神经营养作用,而且能够促进神经元的再生,改善神经元的病理状态,对缺血缺氧后神经损伤具有重要的保护和修复作用[3]。在脑缺血性损伤中,NGF对减轻神经元损伤和增强损伤修复、提高存活率有其重要作用。其作用机制[4-5]包括:①提高过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶的活性,清除氧自由基,减轻神经元损伤;②拮抗谷氨酸等兴奋性氨基酸的脑毒性作用;③稳定神经元胞浆内Ca2+水平,从而保护损伤神经元;④调节凋亡基因的表达,抑制神经细胞凋亡,对缺血后神经元具有保护作用。此外本实验研究显示,NGF可抑制脑缺血再灌注后与炎症相关的多种细胞因子的表达,从而抑制这些炎性因子的“炎性瀑布”效应,减轻炎症反应,减轻脑组织损伤。这为NGF保护脑缺血再灌注损伤的机制又补充了一种新的解释[6]。

脑缺血时,可刺激大脑皮层及海马结构中内源性NGF表达增加,但维持时间短暂,增加幅度有限,不能对受损神经元起到全面、持久的保护作用。因此人们很自然地想到了补充外源性NGF以减少神经细胞的损害。以往认为NGF是大分子多肽,不能通过血脑屏障,一般通过侧脑室给药,该用法在临床实际应用有一定难度。近年来研究[7]显示通过外周注射NGF也可以完整透过血脑屏障,有学者将NGF标记后肌注给药,在脑内检测到有NGF的分布。其机制[8]可能为:①缺血后血-脑屏障不可避免遭到破坏,从而使NG能直接透过血-脑屏障,进入脑组织中发挥脑保护作用;②其他特殊的转运机制:中枢神经系统存在血-脑屏障旁路,能以胞吞方式转运大分子物质,主要经脑室的脉络丛和内皮细胞等部位进行。

综上所述,NGF对大鼠局灶性缺血再灌注损伤有保护作用。保护作用表现为减少脑缺血再灌注组织中炎性细胞因子 TNF－ α、IL－1β、IL－6的合成和释放,改善氧自由基代谢,减轻大脑神经细胞的凋亡等多个方面。虽然NGF在动物实验研究中展示了良好的神经保护作用,但在临床应用中并未取得预期的效果。下一步要继续研究NGF的最佳用药时机、剂量、给药方式、给药次数、疗程等。此外,脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程,单一治疗方法必定难以奏效。针对损伤各环节的不同机制,联合运用不同的药物治疗、细胞因子治疗、基因治疗、中医药治疗、物理治疗等多种方法,从而提高缺血性脑血管疾病的疗效,是今后有待进一步深入研究的方向。

[1] Mori K,Obara Y,Hirota M,et al.Nerve growth factor－in2 ducing activityof Hericium erinaceus in 1321N1 human astro2 cytoma cells[J].Biol Pharm Bull,2008,31(9):1727.

[2] Sasaki M,Honmou O,Kocsis J D.A rat middle cerebral artery occlusion model and intravenous cellular delivery[J]. Methods Mol Biol,2009,549:187.

[3] 张燕平.神经生长因子对脑梗死大鼠的神经保护作用[J].中国现代医生,2010,48(1):7.

[4] Mizuno T,Kuno R,Nitta A,et al.Protective effects of nicergoline against neuronal cell death induced by activated mineroglia and astrocytes[J].Brain Res,2005,1066(1－2): 78.

[5] Jin S,Kawanokuchi J,Mizuno T,et al.Interferon－beta is neuroprotective against the toxicity induced by activated mi2 croglia[J].Brain Res,2007,1179:140.

[6] Linker R,Gold R,Luhder F.Function of neurotrophic fac2 tors beyond the nervous system:inflammation and autoim2 mune demyelination[J].Crit Rev Immunol,2009,29(1): 43.

[7] 刁士元.神经生长因子对大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响[J].临床神经病学杂志,2004,17(6): 450.

[8] Li C,Zhang X,Cao R,et al.Allografts of the acellular sci2 atic nerve and brain－derived neurotrophic factor repair spinal cord injury in adult rats[J].PLoS One,2012,7(8): e42813.