橘红色形态标记在抗根肿病橘红心大白菜雄性不育系转育中的应用

耿新翠 沈向群 李 茜 陈永浩 郭艳峰

（沈阳农业大学园艺学院，辽宁沈阳 110866）

根肿病由根肿菌（Plasmodiophora brassicae）引起，是十字花科作物的一种专性寄生病害，在世界上许多国家都有发生，并且给十字花科作物生产造成了巨大损失。大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕由于生长期长、生长期间气候条件适宜根肿菌侵染而发病更加严重（Dixon，2009）。近年来我国根肿病发病面积逐年扩大，大白菜、普通白菜等十字花科作物的产量和品质严重下降（孙保亚和沈向群，2005）。橘红心大白菜是大白菜中的稀有颜色，营养和保健价值比普通大白菜高出许多倍（张德双 等，2004），是大白菜球心色和品质育种的一个有价值的发展方向。但是根肿病发病面积的迅速扩大势必影响到橘红心大白菜在我国的栽培，转育橘红心大白菜抗根肿病雄性不育系虽然是解决根肿病为害的一个有效手段，但是转育过程中需要进行抗性鉴定、育性调查和球心色筛选，这是一个繁琐的过程。

形态标记具有直观、简单、无需任何分析就可以直接得到结果的优点，是所有标记方法中最简单、最直观、最经济的方法，也是遗传研究和杂种鉴定常用的传统方法（庞金安 等，2009）。利用形态标记可以提高种子纯度和选育效率（吴新杰 等，2005）。随着杂种优势的利用和发展，形态标记在杂种鉴别、纯度鉴定和品种权益保护中具有重要意义。橘红心大白菜的球心色由1对隐性等位基因控制（余阳俊 等，1993），花色、子叶颜色与球心色的遗传关系是一因多效，根据子叶颜色或花色就能判断其球心色，可以把子叶颜色和花色作为橘红心大白菜的形态标记性状在育种中加以应用（李跃飞，2011）。本试验在转育抗根肿病橘红心大白菜雄性不育系的过程中用球心色法、子叶法和花色法分别筛选橘红心性状，对这3 种方法的应用过程进行比较、分析，提出了简化抗根肿病橘红心大白菜雄性不育系转育进程的方法，为橘红心大白菜形态标记在育种中的应用提供了一定的实践经验和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

抗根肿病白心大白菜甲型两用系（CRAB9112A）与橘红心大白菜自交系LH 杂交后代F1分别进行回交和系内交得到的BC1F1和F2，回交亲本为LH。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 本试验于2010～2011年在沈阳农业大学蔬菜基地进行。

第1 组试验于2010年7月2日进行，BC1F1和F2种子各2 份，第1 份浸种后放在培养皿中，室温暗箱条件下培养，子叶展开（2～3 d）后，置于阳光下2 h 后调查子叶颜色，7月5日统计橘红色子叶和黄色子叶的幼苗数目，橘红色子叶幼苗与第2 份种子同时进行抗性鉴定，8月7日进行抗性调查，抗病的植株栽到大田中，结球期第1 份调查经济性状，第2 份调查经济性状和球心色。11月初收获后，存放在地窖中。立春前后栽到花盆中，开花后调查育性。

第2 组试验于2010年6月进行，BC1F1和F2种子各2 份，分别浸种催芽后春化（0～3 ℃，遮光）处理30 d（6月5日～7月5日），春化结束后第1 份置于阳光下2 h 后，统计橘红色子叶和黄色子叶的幼苗数目，橘红色子叶幼苗与第2 份同时（7月5日）进行抗性鉴定，8月7日进行抗性调查，抗病的植株栽到穴盘内（50 穴·盘-1），开花后分别调查花色、育性。

1.2.2 抗性筛选方法 采用菌土置入法接菌，供试菌种为沈阳新民大白菜主产区采集的根肿病菌。按照15 g 鲜质量病根配制100 mL 菌液〔利用菌落计数法计算菌液孢子浓度，应达到12×107个·mL-1（高桥贤司和刘学敏，1989）〕加入300 g 风干草炭土的比例配制菌土，在23～28 ℃条件下密封48 h，使其充分发酵。将发酵过的菌土放入每穴的中央（50 穴·盘-1），每穴放菌土9 cm3，种子或芽保证播到菌土上，苗床地温控制在25 ℃左右，土壤湿度保持在90%左右，pH值控制在6～7，为植株发病营造良好条件，30 d 后洗根，进行调查。

1.2.3 样本容量 样本容量按n≥lg（0.01）/lg（1-p）求得，式中n为样本容量，p为目标基因发生概率。

2 结果与分析

2.1 抗根肿病橘红心大白菜筛选过程比较

抗根肿病橘红心大白菜不育系转育时第2 代（F1进行回交或系内交得到的）是得到橘红心植株的关键步骤。非种子春化处理时，球心色法先抗性筛选，抗病植株球心色和经济性状的筛选在大田里同时进行，然后在经济性状符合要求的抗病橘红心植株中进行育性调查，得到需要的育性基因型；子叶法先调查子叶颜色，只有橘红色子叶幼苗进行抗性筛选，抗病橘红心植株进行经济性状调查，符合要求的做育性调查。子叶法和球心色法相比，抗性筛选和球心色（或子叶色）调查先后顺序不同，但都是最后进行育性鉴定。具体过程如图1所示。从表面看，利用子叶法筛选橘红心植株似乎更繁琐，其实不然，子叶法操作简单方便，仅需要2～3 d 就可以完成，可以说两种方法在时间耗用上几乎是一样的。

图1 非种子春化处理抗根肿病橘红心大白菜筛选方法比较

种子春化处理时幼苗不经过结球期直接进入开花期，通过子叶颜色和花瓣颜色都可以找到橘红心植株，所以橘红花和橘红子叶都可以作为形态标记性状用于筛选橘红心植株，但是二者在具体应用时有所不同。花色法在春化处理结束后进行抗性筛选，抗病植株开花后花色和育性调查同时进行。而子叶法在春化处理结束后，幼苗先在阳光下照射2 h，橘红心幼苗子叶颜色由黄色变为橘红色而白心幼苗子叶依然是黄色，淘汰黄色子叶幼苗，橘红色子叶幼苗进行抗性鉴定，抗病橘红心植株开花后调查育性。具体过程如图2所示。可以看出，与非种子春化处理类似，子叶法和花色法相比，也是抗性筛选和花色（或子叶色）调查顺序不同，耗用时间几乎一样。

图2 种子春化处理抗根肿病橘红心大白菜筛选方法比较

因此，球心色法、花色法和子叶法相比，球心色法是经济性状调查和球心色调查同时进行，花色法是花色调查和育性调查同时进行，而子叶法是子叶色、抗性、经济性状、育性逐一筛选。另外，子叶法在种子春化处理和非种子春化处理应用过程基本相同，只是种子春化处理少了田间经济性状调查这一阶段。

2.2 不同方法筛选理想橘红心植株各步骤比较

在转育抗根肿病橘红心大白菜核基因雄性不育系过程中，无论是种子春化处理，还是非种子春化处理，抗性筛选、球心色调查和育性调查缺一不可。方法和材料不同时，抗性筛选、球心色调查所需要的株数也会不同。

当F1通过回交得到橘红心植株时，BC1F1抗病和感病、白心和橘红心、可育和不育的理论分离比都是1∶1。非种子春化处理，球心色法每一份材料需要40 株进行抗性筛选，选出的抗病植株约20 株进行球心色和经济性状调查，最后选7 株抗病橘红心植株进行育性调查（表1）。子叶法先从40 株子叶展开的幼苗中淘汰子叶黄色的幼苗，保留橘红色子叶的幼苗约20 株进行抗性筛选，抗病植株10 株左右进行经济性状筛选，选7 株进行育性调查（表2）。在调查总数相同的情况下，子叶法抗性筛选株数、经济性状调查株数只有球心色法的50%左右。

种子春化处理时，子叶法在春化处理后先调查40 株幼苗子叶颜色，橘红色子叶幼苗约20 株进行抗性筛选，选7 株抗病橘红心植株盆栽进行育性调查（表3）。花色法先对40 株幼苗进行抗性筛选，抗病植株约20 株盆栽进行花色和育性调查（表4）。花色法需要抗性筛选和育性调查株数多，而子叶法在抗性鉴定前淘汰了非橘红心幼苗，抗性筛选和育性调查株数大大减少。

除了抗性筛选株数和育性调查株数不同外，从调查过程所需时间来看，非种子春化处理子叶法和球心色法相比，子叶法比球心色法多了子叶调查这一步骤，但是从各个步骤所需要的时间来看，抗性筛选30 d，经济性状调查100 d 左右，子叶调查仅仅需要2～3 d 的时间。同样，种子春化处理子叶法也是多了子叶颜色调查这一步骤，但是这一步骤费时更短，仅仅需要几个小时的时间。可以说，从BC1F1获得理想橘红心植株，球心色法和子叶法或者花色法和子叶法所需时间差别不大，但子叶法不仅抗性筛选株数少，大田种植或盆栽株数也减少许多，这意味着在管理过程中工作强度降低，节省了人力和物力。

F1兄妹交得到橘红心植株（F2），抗病和感病理论分离比是3∶1，抗病植株较多，约占总株数的3/4，白心和橘红心理论分离比是3∶1，但橘红心植株约占总株数的1/4；育性基因型理论分离比为1∶1∶1∶1（MS fMS∶MS fms∶msms∶Msms）。在这种情况下，为了得到理想的基因型，子叶法更加显示出其优势（表5～8）：在总调查株数为96 株的前提下，先确定橘红心植株，淘汰了约占总数3/4 的非橘红心植株，只有1/4 橘红心幼苗进行抗性筛选，而其他方法抗性筛选株数都是96 株；相应地，非种子春化处理子叶法大田种植株数大约为球心色法的1/3，种子春化处理子叶法盆栽株数大致为花色法的1/3。由此可见，从F2筛选理想的橘红心植株，子叶法依然是最简便、省力的方法。

表1 非种子春化处理球心色法从BC1F1获得理想橘红心植株各步骤调查株数 株

表2 非种子春化处理子叶法从BC1F1获得理想橘红心植株各步骤调查株数 株

表3 种子春化处理子叶法从BC1F1获得理想橘红心植株各步骤调查株数 株

表4 种子春化处理花色法从BC1F1获得理想橘红心植株各步骤调查株数 株

与BC1F1获得理想橘红心植株相比，F2要获得理想橘红心植株，球心色法抗性筛选株数、经济性状调查株数和育性调查株数明显增加；花色法抗性筛选株数、盆栽株数也明显增加；子叶法先淘汰了约占总数3/4 非橘红心幼苗，抗性筛选总数反而明显减少。因此，当橘红心植株出现的概率由回交时的1/2 降为系内交的1/4，调查总数增加时，子叶法由于首先淘汰了占多数的非橘红心植株而使随后的抗性、经济性状和育性调查株数大幅缩减，这对于后期的管理工作十分有利，这说明随着橘红心出现概率的降低，子叶法变得更加方便、实用。

2.3 不同方法根肿菌菌土用量比较

抗性鉴定时，每穴放菌土9 cm3，定苗2株。从表9 可以看出，材料相同时，球心色法和花色法菌土耗用量相同，子叶法菌土耗用量较少；材料不同时，同一种方法菌土耗用量不同。F2获得抗病橘红心植株的概率（3/16）低于BC1F1（1/4），所以F2调查群体增加，球心色法和花色法菌土耗用量也相应增加。但是，由于F2获得抗病植株的概率（3/4）高于BC1F1（1/2），子叶法的抗性筛选群体反而减少，菌土耗用量低于BC1F1。这说明在转育橘红心材料时，子叶法可以先淘汰非橘红心植株，省去了非橘红心材料的抗性筛选，减少了抗性筛选群体，节省了菌土。

表5 非种子春化处理球心色法从F2获得理想橘红心植株各步骤调查株数 株

表6 非种子春化处理子叶法从F2获得理想橘红心植株各步骤调查株数 株

表7 种子春化处理子叶法从F2获得理想橘红心植株各步骤调查株数 株

表8 种子春化处理花色法从F2获得理想橘红心植株各步骤调查株数 株

表9 不同条件下、不同方法BC1F1和F2获得抗根肿病橘红心植株抗性筛选所需菌土量比较

3 结论与讨论

形态标记性状除了稳定性强之外，特征必须明显，易于识别，如果能够早期识别更好（庞金安 等，2009）。橘红色子叶对黄色子叶、橘红花对黄花颜色差别明显，容易区分，适合作为形态标记加以运用。非种子春化处理，橘红花形态标记在植株生长后期开花期才得以表现，比球心色表现的晚，所以没有必要使用。如果不调查经济性状直接种子春化处理，可以在花期利用这一性状确定橘红心植株，但管理的工作量会增加。橘红色子叶形态标记在种子子叶展开时就表现出来，可以早期识别橘红心植株，并且无论非种子春化处理还是种子春化处理都可以在幼苗期将橘红心植株挑选出来，应用价值较高。

本试验以转育抗根肿病橘红心大白菜雄性不育系的BC1F1和F2为试材，在非种子春化处理和种子春化处理两种条件下比较了球心色法、子叶法和花色法得到抗根肿病橘红心植株的过程，得出如下结论：第一，球心色法是经济性状调查和球心色调查同时进行，花色法是花色调查和育性调查同时进行，子叶法是子叶色、抗性、经济性状、育性逐一筛选。第二，非种子春化处理，子叶法比球心色法抗性鉴定群体小，田间调查株数少；种子春化处理子叶法比花色法抗性鉴定群体小，盆栽株数少。第三，F2样本容量虽然比BC1F1大，但子叶法的抗性鉴定群体反而减少。这说明在橘红心植株出现的概率较小调查群体增加时，子叶法可以早期淘汰非橘红心植株，减少劳动量，方便以后的管理。第四，从根肿菌菌土耗用量来看，子叶法需要的菌土量最少，抗性鉴定结束后需要灭菌的土量也最少。根肿菌休眠孢子生活力很强，在土壤中可以存活10 a以上。化学药剂防治困难，同时还会带来环境污染等问题。子叶法在抗性鉴定时减少了菌土耗用量，也就是说抗性鉴定结束后要处理的带菌土量也随之减少，这对于减少或防止试验后根肿菌污染也是有利的。因此，球心色法、子叶法和花色法3 种方法中，子叶法适用范围最广，最经济，最方便，是筛选橘红心抗病品种和不育系的理想方法。

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