薄层色谱和荧光分析法测定黄连生物碱在高速逆流色谱溶剂体系中分配系数的方法

纪 佳

郑州人民医院药剂科，河南郑州 450000

黄连是一种我国常用的中药，味苦，性寒，有清热燥湿、泻火解毒的治疗功效，临床上用来治疗心烦、腹痛、呕吐、脉促、下利等。经研究发现黄连中主要含有的生物碱有小檗碱、黄连碱、巴马汀等原小檗碱型的生物碱。本研究观察薄层色谱和荧光分析法测定黄连生物碱在高速逆流色谱溶剂体系中分配系数的方法，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

国产高速逆流色谱仪（T300B），日本产荧光分光光度计（F4500），国产紫外仪，国产超声波清洗器（KQ250B），国产旋涡混合器（XW80A），国产微量高速离心机（TG16W），国产薄层色谱硅胶板。

1.2 试药

黄连碱标准品，小檗碱标准品，巴马汀标准品，表小檗碱标准品（以上药品均购自中药药品生物制品检定所），色谱纯乙腈，分析纯其他试剂。

2 方法

2.1 标准溶液的制备

分别精密称取黄连碱、小檗碱、巴马汀、表小檗碱的对照品2 mg，分别于4 mL无水乙醇中100 KHz超声溶解5 min，即得对标准品溶液，放置在0℃环境中进行保存备用[1]。

2.2 样品溶液的制备

称取黄连70%的乙醇提取物浸膏4 g（已知含有黄连碱9.21%，巴马汀3.98%，表小檗碱3.45%，小檗碱18.50%）于4 mL无水乙醇中100 KHz超声溶解5 min，即得样品溶液，放置在0℃环境中进行保存备用[2]。

2.3 供试品溶液的制备

称取适量的黄连总生物碱粗提物，将其溶解于氯仿（4）︰甲醇（1.5）︰0.2 mol/L盐酸（2）溶液体系中，进行完全溶解后静置等待分层，收集等量的上下相，即得对供试品溶液，放置在0℃环境中进行保存备用。

2.4 薄层色谱条件

使用10 cm×10 cm，厚度为3 mm的薄层板；使用的展开剂为环己烷（3）︰乙酸乙酯（3.5）︰异丙醇（1）︰甲醇（1.5）︰水（0.5）︰三乙胺（1）。首先将适量的黄连生物碱样品用毛细管在硅胶薄层板上进行点板，然后将点好样品的薄层板放置在已使用氨水预饱和20 min的展开缸里，进行展开，展开后取出晾干，放置在365 nm紫外灯下进行检测[3]。

2.5 荧光分析方法

将点有样品溶液的薄层色谱板展开后放置在365 nm紫外灯下进行检测，在对应的荧光斑点的位置画出标记，进行定量的样品刮取，将样品放置在1.5 mL的离心管中后，加入1 mL的无水乙醇进行涡旋摇匀后使用超声仪20 min进行提取，在使用设定在4 000转/min的离心仪进行5 min离心操作后，移取上清液放置在1.5 mL的离心管中，再吸取样品适量加入无水乙醇2 mL，摇匀后进行样品的荧光强度分析，设定荧光光谱的波长为409 nm，激发光波长为365 nm，入射狭缝带宽为5 nm，出射狭缝带宽为5 nm，设定环境温度为25℃。

2.6 线性关系考察

精密分别吸取浓度为0.5g/L的含4种黄连碱的标准品溶液 1、2、3、4、5、6 μL，进行点板、展开、刮板、提取，按“荧光分析方法”下进行各样品荧光强度的检测，以样品浓度和荧光强度进行线性回归，计算4种生物碱的实验检测的线性范围以及回归方程。

2.7 加样回收实验

精密称取4种已知含量的生物碱样品溶液，在1.0、1.5、2.0 g/L 3个水平加入混合对照品溶液在每个水平进行6次平行检测，计算回收率。

2.8 薄层色谱和荧光分析法测定分配系数计算

使用毛细管对黄连生物碱的上下相溶液进行等量吸取，并均点于同一个硅胶薄层板之上，在“薄层色谱条件”下进行展开后，使用“荧光分析方法”下进行刮板和提取，测定上下相中的4种黄连生物碱各自的荧光强度，并且在第3、5、8、10日进行重复性的测量，将测定值进行相比计算出样品各自的分配系数。

3 结果

3.1 实验准确度

得到黄连素的回归方程是I=442.79+139.86c（r=0.999 9），线性范围为0.5~2.5 g/L；表小檗碱的回归方程是I=489.89+153.80c（r=0.999 8），线性范围为0.5~2.5 g/L；小檗碱的回归方程是I=395.5+167.45c（r=0.999 9），线性范围为 0.5~2.5 g/L；巴马汀的回归方程是I=356.9+173.89c（r=0.999 9），线性范围为1.0~3.0 g/L。在线性范围内4种生物碱均具有良好的线性关系。见表1。

表1 4种生物碱的线性回归方程以及回归系数

3.2 实验回收率

得出黄连碱的平均加样回收率为98.3%，相对标准偏差RSD为1.93%；表小檗碱的平均加样回收率为103.9%，相对标准偏差RSD为2.61%；小檗碱的平均加样回收率为95.3%相对标准偏差RSD为3.36%；巴马汀的平均加样回收率为97.6%，相对标准偏差RSD为3.72%。

3.3 薄层色谱和荧光分析法测定分配系数

黄连碱的Rf值是0.74，分配系数是2.20；表小檗碱的Rf值是0.61，分配系数是1.60；小檗碱的Rf值是0.29，分配系数是0.83；巴马汀的Rf值是0.21，分配系数是0.83。

4 讨论

本研究当黄连生物碱的样品在溶剂体系分配平衡之后，收集等量的上下相，使用薄层色谱法进行点板，展开等操作后使用荧光分光光度分析法对黄连生物碱的样品荧光值进行检测，计算黄连生物碱在高速逆流色谱溶剂体系中的分配系数。确定在线性范围内4种生物碱均具有良好的线性关系；黄连碱的Rf值是0.74，分配系数是2.20；表小檗碱的Rf值是0.61，分配系数是1.60；小檗碱的Rf值是0.29，分配系数是0.83；巴马汀的Rf值是0.21，分配系数是0.83。不但有效的避免了中药复杂成分中的相互之间的干扰[4]，同时也显著性的提高进行中药化学分析的真确度和灵敏度。综上所述，使用薄层色谱和荧光分析法对黄连生物碱在高速逆流色谱溶剂体系中分配系数进行测定具有检测时间短、准确度高、应用范围比较广的诸多优点，值得推广使用。

[1] 贺凯，李学刚，陈红英，等.薄层色谱—荧光法测定黄连素生物碱分配系数[J].分析化学，2011，39（4）：572-575.

[2] 苏本正.黄连配方颗粒薄层鉴别方法研究[J].山西中医，2011，27（11）：49-50.

[3] 王道武，庞雪，赵全成，等.黄连生物碱的反相高效液相—电喷雾离子阱串联质谱的研究[J].分子科学学报，2011，27（3）：189-193.

[4] 于俊林，杨文娣，王朝晖.鲜黄连生物碱成分研究[J].中药材，2003，26（10）：727-728.