MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型肾脏中IL-17A表达的实验研究

陆玉蕾 林有智 朱 琳 王晓晶 严伟明 宁 琴▲

1.华中科技大学附属同济医院感染性疾病研究所、感染病科，湖北武汉 430030；

2.华中科技大学附属同济医院肝脏外科实验室，湖北武汉 430030

肝炎病毒感染能够导致多种肾脏疾病，引起肾脏损伤。在亚洲国家，乙型肝炎病毒是膜性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎和IgA肾病的常见病因之一。丙型肝炎病毒是冷球蛋白血症介导的肾小球肾炎的主要致病原[1]。但是肝炎病毒引起肾脏损伤的致病机制目前尚未完全清楚。本研究用3型鼠肝炎病毒（3 types of mouse hepatitis virus，MHV-3）感染 C3H/HeJ小鼠后建立了小鼠病毒性肝炎模型[2]。前期研究发现在该模型中存在肾组织的损伤[3]。本研究通过观察该模型中肾脏白细胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）的表达情况，分析细胞因子IL-17A在肝炎病毒引起肾脏损伤发生、发展中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 MHV-3为本研究室保存病毒株，分装冻存于-170℃液氮中。使用滴度为1×106pfu/mL。

1.1.2 动物模型 6～8周龄（18～20 g）雌性SPF级C3H/HeJ小鼠购自上海实验动物中心，购回后饲养在动物房洁净层柜（IVC系统）内，恒温、恒湿条件下自由摄取食物和水。小鼠随机分为两组：模型组和对照组各50只。模型组小鼠腹腔注射200 μL含10 pfu MHV-3的生理盐水液，对照组小鼠腹腔注射200 μL PBS液。在注射前（第0天）和注射后的第5、10、15天分批收集两组小鼠肝脏组织标本。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色 用LSAB法，3 μm厚肾组织石蜡切片，常规脱蜡至水，3%H2O2处理内源性过氧化物酶，抗原热修复并封闭后，加入一抗：IL-17A（Santa cruze），4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，滴加生物素标记二抗，37℃孵育1 h，滴加试剂SABC 37℃孵育1 h，加入增敏二氨基联苯胺（DAB）液，显微镜下控制显色，苏木紫复染，梯度酒精脱水干燥，性树胶封固。同时采用Tris-HCl缓冲盐溶液（TBS）代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 肾脏组织中L-17A mRNA的检测 采用Trizol法提取总RNA，取2 μg总RNA逆转录成cDNA。Real time PCR 反应：（1）IL-17A引物上游序列：5’-GGCTGACCCCTAAGAAACC-3’；下游序列：5’-CTGAAAATCAATAGCACGAAC-3’，（2）mGAPDH引物上游序 列：5’-CTCATGACCACAGTCCATGCCATC-3’；下游序列：5’-CTGCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’。具体反应步骤：95℃预变性 2 min，95℃ 20s，57℃ 30s，72℃ 30s共 40个循环。

1.3 统计学处理

采用SPSS10.0统计软件处理，计量资料用（x ± s）的形式表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功建立实验性小鼠病毒性肝炎模型

模型组肝脏组织有大量的淋巴细胞以及少量的中性粒细胞的浸润；感染后3 d开始出现肝细胞水肿、气球样变、点状坏死、灶状坏死甚至碎片状坏死，以感染后第10天最为严重。而对照组肝组织结构基本正常。

2.2 肾脏组织的病理改变

病理结果显示，光镜下感染MHV-3后模型组大量肾小管上皮细胞肿胀坏死，肾间质严重充血，有大量炎性细胞浸润。而对照组肾脏组织结构基本正常。见图1。

A：对照组小鼠肾脏组织；B：感染MHV-3第10天模型组肾脏组织图1 MHV-3感染对小鼠肾组织病理改变的影响（HE染色×400）

2.3 MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型肾脏组织中IL-17A的表达

免疫组化染色结果显示，感染MHV-3 10 d后，小鼠肾脏组织中表达IL-17A，可见近曲小管和肾间质出现IL-17A较强阳性着色，见图2。随着MHV-3感染时间的延长，肾脏组织IL-17AmRNA水平较第0天逐渐升高（P＜0.05），在MHV-3感染后第10天达到高峰（8.31±2.72），见表1。

A：对照组小鼠肾脏组织；B：感染MHV-3第10天肾脏组织图2 IL-17A在MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型肾脏组织中的表达（DAB显色，×200）

表1 IL-17A在MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型肾脏组织中的表达变化（x ± s）

3 讨论

IL-17A是近年发现的一种新型促炎性细胞因子。IL-17A被证实可以促进IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、前列素E2和基质金属蛋白酶等的表达，参与多种炎性反应过程，引起炎性细胞浸润和组织损伤[4]。此外，IL-17A具有募集中性粒细胞的生物学作用，它能通过诱导中性粒细胞趋化因子的表达如CXCL1、CXCL2、CXCL8等，进一步促进中性粒细胞和单核细胞的侵润，造成炎性反应，并进一步加剧组织的损伤[5]。目前大量的研究表明IL-17A和肾脏疾病密切相关，在多种肾脏疾病，如原发性肾病综合症（primary nephrotic syndrome，PNS）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、肾功能衰竭等病理过程中发挥了重要作用[6]。笔者研究观察到，在MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型中，肾脏组织IL-17A的水平显著增加，可以推测肾脏组织表达的IL-17A可能参与MHV-3感染引起的肾脏损伤的病理过程中。此外，IL-17A能够促进TNF-α的产生[7]，TNF-α表达的增加将进一步加剧肾脏的损伤。综上所述，IL-17A可能在MHV-3感染造成肾脏损伤的病理过程中发挥重要作用，但是其具体的作用机制还有待进一步研究。

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