甲型流感病毒蛋白和遗传物质在宿主细胞质内顺向转运过程及其机制

池晓娟，王松，黄一帆，陈吉龙

1 福建农林大学动物科学学院动物医学系, 福建 福州 350002

2 中国科学院微生物研究所 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101

甲型流感病毒由3个主要的亚病毒成分组成：1) 三种跨膜蛋白，包括血凝素 (Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶 (Neuraminidase，NA) 和基质蛋白2 (Matrix protein 2，M2)；2) 中间层基质蛋白M1；3) 内部螺旋形的核糖核蛋白 (vRNP)[1]。流感病毒利用宿主细胞的复制机制，完成自身组分的合成和转运[2]。病毒首先通过囊膜上的 HA糖蛋白与宿主细胞表面的唾液酸受体相结合[3]，吸附于宿主细胞表面，再通过内吞作用进入细胞内。然后H+经M2离子通道进入病毒粒子内，使病毒内部的 pH值由中性变为酸性。此时，HA的构象发生改变，形成α螺旋，暴露融合肽，使病毒与宿主细胞相互融合，将病毒的内部组分释放出来[4]。vRNP和M1进入细胞核，开始病毒基因组的转录与复制过程。编码病毒蛋白的mRNAs经由 NXF1/TAP (Nuclear RNA export factor 1) 作用出核[5]。病毒的HA、NA和M2蛋白在粗面内质网中翻译，又经高尔基体向细胞膜的病毒包装位点处转运。另一方面，病毒基因组RNA与核蛋白 (Nucleoprotein，NP) 形成vRNP复合物，经CRM1介导出核，在这一过程中病毒蛋白M1、NP和非结构蛋白NS2发挥重要作用[6-10]。新合成的vRNPs以及其他病毒蛋白出核后也向特定的病毒包装位点转移，各组分之间发生有序的相互作用，开启病毒粒子的包装和出芽过程。病毒粒子的形态发生需要各组分准确的转运到相应的包装位点和正确的分类排序。在某种程度上，这一过程有赖于宿主细胞转运机制的精确时空调控作用。以下将主要阐述新合成的流感病毒跨膜蛋白和基因组在宿主细胞质内的顺向转运过程及其机制，有助于我们更加深入地了解流感病毒的致病机制，为抗流感药物的设计提供参考依据。

1 跨膜蛋白的转运过程

流感病毒的HA、NA和M2这3个跨膜蛋白在宿主细胞的粗面内质网核糖体内合成。然后，它们被转运到高尔基体，并由高尔基体反面网络状结构 (TGN) 出高尔基体，再由各自的运输小泡向细胞膜运输[11]。流感病毒的跨膜蛋白根据顶端分选信号 (Apical sorting signals) 在细胞膜上有序地分类排列[12]，其中M2的分选信号仍不完全清楚。流感病毒的跨膜蛋白在宿主细胞质内顺向转运过程中经过不断的糖基化等修饰，HA和NA被折叠和糖基化后，HA组装成三聚体，NA和M2则组装成四聚体。

1.1 HA的转运过程

HA是典型的I型糖蛋白，它是流感病毒最主要的表面糖蛋白，其三聚体的头部含有3个受体结合位点。它与唾液酸受体的结合，是流感病毒吸附于宿主细胞的关键步骤。因此，HA是流感病毒不可缺失的部分，必须准时并且准确地转运到包装位点，进入子代病毒粒子。

HA在核糖体内翻译后，又在氨基末端信号的促进下，生成多肽链。随后移入粗面内质网腔内，再进入高尔基体加工修饰。在这个过程中，HA发生一系列的共翻译修饰和翻译后修饰：在粗面内质网中，HA附加上N-糖苷侧链碳水化合物；在高尔基体内，重装寡糖和通过蛋白水解酶作用将HA前体裂解成HA1和HA2。过表达高尔基体微管相关蛋白 210 (GMAP-210) 会阻碍HA从内质网向高尔基体的顺向运输[13]。最后，HA由TGN运输到细胞膜表面，GTP结合蛋白参与该过程[14]。例如，小 G蛋白 Rab6会调控HA在TGN的转运，表现为抑制其顺向转运或正向调节其逆向运输[15]。

关于HA自身结构的研究显示，位于HA跨膜区 (TMD) 中间部分的氨基酸序列对HA向细胞膜转运的顶端分选 (蛋白质分选) 有重要作用，外质部分对脂筏结合有重要作用。相关研究发现，损耗宿主细胞的胆固醇后，野生型HA进入脂筏的能力减弱，但在顶端和基底外侧部的分类排列不受影响。研究发现，HA跨膜区的 520和521位氨基酸突变后，在脂筏存在时，HA突变体向细胞膜表面的转运受抑制。而将宿主细胞胆固醇损耗后，该HA突变体则能随意的转运[16]。由此可见，HA进入脂筏是其顶端分选的必要条件，但非充分条件。可能在HA顶端分选排列时，它的跨膜区还要结合其他蛋白或者脂类。另外，删除HA的胞质区尾部能减弱HA与脂筏的连接，但对其顶端转运 (Apical transport) 无影响[17]。Brewer和Roth发现在MDCK细胞中，经突变的HA (Cys543→Tyr543) 不会向细胞膜的顶端部位转运，而是直接转运至基底膜，但它在胞内的运输以及在细胞表面的表达均不受影响[18]。

HA出高尔基体的TGN后，经胞吐通路向细胞膜上转运。除小G蛋白Rab外，目前还不完全清楚其他宿主因子参与调控这一过程的情况。早期的研究显示抗小窝蛋白1 (Caveolin-1) 抗体会抑制HA在MDCK细胞中的转运[19]。然而，Manninen等在观察敲除caveolin-1的MDCK细胞和正常MDCK细胞内HA向细胞膜表面转运时，发现两者并无明显差异。因此，他们认为，caveolin-1不是HA向细胞膜表面有效转运所必需的宿主因子[20]。对于两种研究得出的不同结果，Scheiffele等认为，可能是因为caveolin-1抗体与高分子量的caveolin-1寡聚物结合后，使顶端转运出现空间障碍，导致HA的转运受抑制。至于HA是否还受到其他宿主因子的调控了解甚少，有待进一步研究。

1.2 NA的转运过程

流感病毒粒子出芽后，由于HA与宿主细胞表面的唾液酸相互作用，病毒粒子仍然附着在细胞膜上。所以，病毒粒子的有效释放需要依赖于NA蛋白的活性。NA为糖苷外切酶，可以从α-糖苷键上去除唾液酸残基，使病毒粒子脱离宿主细胞受体而释放[21]。Calder等研究发现，NA聚集在出芽病毒粒子的某单一位点上[22]，反映了NA在病毒粒子从细胞表面释放过程中起重要作用。另外，也有一些研究结果显示NA参与流感病毒的形态发生及出芽过程[1,23-24]。由此可见，有效地将NA转运到细胞膜表面是子代流感病毒颗粒的形态发生、出芽和成功地从感染细胞中释放的重要前提条件。

NA是 II型跨膜糖蛋白。Kundu等通过对NA跨膜区的研究，首次证明了其跨膜区在蛋白质分选和脂筏结合中的作用[25]。NA跨膜区中数个肽段含有蛋白极性运输的信号。Nayak实验室研究发现，位于NA跨膜区的19个氨基酸(aa 9-27) 能够充分介导NA向细胞膜运输，跨膜区的序列对于NA与脂筏结合也有重要作用。虽然这些序列有重叠部分，但是它们作用不同，不会相互影响[26]。后来，Barman等对NA跨膜区进行深入研究，发现 NA跨膜区的 aa11-13、aa23-26和aa32-35在NA向细胞膜极性运输中起重要作用[27]。

关于NA在宿主细胞内转运过程中是否受到宿主因子调控的研究报道很少。最近，我们研究发现，分布于宿主细胞质的小G蛋白Cdc42在有活性状态下，能促进NA蛋白向细胞膜上运输，而Cdc42特异的GTP酶激活蛋白ARHGAP21则会抑制该过程，从而影响流感病毒复制[28]。我们研究还发现，流感病毒感染导致了 ARHGAP21表达水平的下调，从而使Cdc42活性升高，有利于NA蛋白向细胞膜上转运[28]。

1.3 M2的转运过程

M2除了具有离子通道功能，目前不少研究证实M2可与胆固醇结合[29-30]，但是当病毒的其他蛋白不表达时，M2则定位于细胞膜的无脂筏区域[31]。Chen等[32]和Rossman等[29]推测M1与M2结合会募集M2于富含脂筏的病毒出芽位点，然后结合胆固醇，使M2稳定地结合在出芽位点，随后成为子一代病毒粒子的结构成分。最近研究发现，位于 M2胞内区尾部的两亲性螺旋(Amphipathic helix) 插入细胞膜，改变出芽部位细胞膜的弯曲度，使其断裂，以利于病毒出芽。含有17个氨基酸的高度保守的M2两亲性螺旋位于正在出芽的病毒粒子的颈部，为细胞膜断裂所必需，参与完成病毒出芽的最后步骤[33]。另有报道，HA、NA、M1和M2蛋白的活性可能可以循序地调试细胞膜的弯曲度而调控病毒出芽过程[34]。

一些研究探讨了新合成的M2在宿主细胞质内的转运过程。Rossman等通过敲除Rab11观察M2蛋白转运是否受影响。结果发现，M2在细胞表面的数量减少了 40%[33]，证明 Rab11在 M2向细胞膜转运过程中起重要作用。有趣的是，M2蛋白高表达时会减慢HA跨膜糖蛋白通过高尔基体的转运速率。用金刚烷胺处理后，HA的转运不受影响，推测 HA在高尔基体内的转运延迟是由于有活性的 M2蛋白使高尔基体与细胞质的pH值平衡，而不是因为胞内转运机器的饱和[35]。

2 vRNPs的转运过程

vRNPs是由8条独立的vRNA片段、聚合酶(PB2、PB1、PA) 及NP蛋白组成。vRNPs从病毒粒子中释放，并随后进入细胞核，在核内复制产生新的vRNPs是一个极其复杂的过程。而关于该过程的研究成果也很多，可参见相关报道[36-40]。而这里主要阐述新合成的 vRNPs从细胞质运输到细胞膜上的顺向转运过程。

新合成的 vRNPs先聚集在微管组织中心(MTOC) 附近，然后依靠NP的蛋白质分选靶向活性，向细胞膜方向运输[41]。因为 NS2在 M1上的结合位点遮盖了M1的核定位信号 (NLS)，所以，可以防止vRNPs再次进入细胞核。同样，NP通过与丝状肌动蛋白结合，将vRNPs滞留在细胞质内[42]。

研究发现，Rab11参与vRNPs从MTOC向细胞膜转运的过程。Rab11是Rab小分子GTPase家族的一个亚家族成员，主要位于再循环胞内体(Recycling endosomes，RE)、TGN和质膜上，它能调节部分蛋白和囊泡在这些细胞器之间的转运过程[43-44]。Rab家族大约有 80个成员，其中Rab5和Rab7等也被报道参与流感病毒成分的转运过程[45-46]。Rab5A可促进病毒从细胞表面内吞进入早期胞内体的转运过程，Rab7则作用于晚期胞内体转运[47]。Rab11与流感病毒之间的关系曾于1998年就有报道，不论是干扰Rab11表达还是过表达GDP分解抑制物 (GDI) 都不会影响流感病毒HA向细胞膜运输[44]。而Rab11对vRNP转运的调控作用是近几年才报道的。Eisfeld等利用NP的单克隆抗体结合免疫荧光法在A549细胞中定位识别vRNP，发现vRNPs在细胞质转运过程的每一个阶段都与Rab11A在一起。通过抑制 Rab11A 的表达或者高表达显性失活的Rab11A突变体，发现vRNP在细胞核周边区域大量滞留，而在细胞膜上却几乎不聚集[48]。Amorim等也报道，有活性的Rab11与vRNP相互作用的效率比失活的 Rab11与之作用的效率高十倍[49]。最新的研究报道指出，新合成的vRNP通过病毒RNA聚合酶与Rab11相互作用，然后定位于含有活性Rab11 (GTP-bound Rab11) 的再循环胞内体中，最后沿着微管向细胞膜转运[50]。Amorim之前也报道说明，vRNP在细胞质中的转运过程需要依赖于微管的作用[49]。

值得注意的是，vRNP的聚集区域不在细胞膜上，而在其附近。所以，Rab11A可能把vRNP传输到细胞膜附近区域后就与vRNP分开，不会同 vRNP一起进入病毒粒子。这一猜想与之前Shaw的研究结果相一致。Shaw等在纯化后的流感病毒粒子中并未发现 Rab11A[51]。Rab11在流感病毒粒子出芽时也发挥重要作用，当 Rab11的表达量减少时，病毒粒子的释放量也随之减少[52]。此外，Eisfeld等研究揭示，细胞内HIV Rev结合蛋白 (HIV Rev-binding protein，HRB) 能够促进流感病毒 vRNPs从细胞核周边区域向细胞膜转运。HRB能与NEP (即NS2) 在细胞核周围相互作用，所以他们认为，NEP对该转运过程可能也有贡献[53]。

由此可见，vRNP从细胞核到细胞膜的转运过程中需要多种宿主细胞成分和细胞结构参与，包括Rab11、HRB、MTOC、再循环胞内体等。然而，vRNP转运的详细机制以及是否还需要其他因素的协助仍待深入研究。

3 小结

综上，我们对流感病毒的跨膜蛋白和基因组在宿主细胞质内的顺向转运过程已经有了一定的认识。跨膜蛋白HA、NA和M2的mRNA在NXF1/TAP的作用下，进入粗面内质网开始翻译并进行修饰，又在高尔基体中进一步修饰，然后它们分别以三聚体或四聚体的形式向细胞膜上的病毒颗粒包装位点转运。期间，Cdc42、Rab11分别参与NA和M2的转运。最后它们依靠各自跨膜区上分选信号和锚定信号的调节，在病毒包装位点有序排列，最终进入病毒粒子。新合成的vRNPs通过CRM1介导从核孔复合体 (NPC) 出核后，先通过与MTOC附近胞内体上的Rab11结合，聚集在 MTOC周围，然后经微管网络向细胞膜的附近区域聚集。vRNP与Rab11二者分离后，vRNP进入病毒粒子，而Rab11返回胞内体 (图1)。

4 展望

图1 流感病毒跨膜蛋白和基因组在宿主细胞质内顺向转运过程。HA、NA和M2的mRNA出核进入粗面内质网合成蛋白质。随后蛋白转运到高尔基体，进行糖基化等修饰，最后通过囊泡运输的形式向细胞膜上的病毒包装位点转运。Cdc42和Rab11分别调节NA和M2的转运过程。新合成的vRNPs经CRM1途径从NPC出核，通过与胞内体中活化的Rab11结合，聚集在MTOC区，然后该复合物经MTOC的微管转运到包装位点附近，vRNP与Rab11分开，vRNP进入病毒粒子。Fig.1 Model of the anterograde transport of the influenza A virus transmembrane proteins and genome in host cytoplasm. HA, NA and M2 mRNAs translocate to rough endoplasmic reticulum following nuclear export. Newly synthesized proteins are modified in ER and then transported to the Golgi, where they are further modified by

流感病毒颗粒的形态发生是病毒致病的关键步骤。当包装流感病毒的所需组分有序地聚集于细胞膜特定位点，为病毒的包装做好准备时，病毒开启其包装机制，包装出成熟的子一代病毒粒子。包装病毒的所需组分缺失或排列混乱时，会严重影响病毒的形态发生过程[1]。由此可见，病毒组分的转运过程必须受到严格的时间和空间调控。然而，病毒组分在宿主细胞转运过程的时空调控机理仍然所知甚少，有待于系统深入的研究。值得注意的是，病毒各组分之间还存在着微妙的平衡关系。如当HA与唾液酸之间的亲和力增强时，NA切除受体的活性就会受到阻碍，从而使病毒的释放量减少；M2表达量过高时会影响HA的转运。这些现象都暗示着，流感病毒的转运、包装和释放是极其复杂的过程，它不仅依赖于宿主细胞的转运机器，还要求自身各组分之间相互协调、作用及达到量效平衡关系。而目前我们对流感病毒这方面的研究虽然已经有了一定的基础，但是还远不够透彻，不论是病毒与宿主细胞之间，还是病毒各组分之间，都有许多未知的相互作用因素需要我们去发现。基于对流感病毒蛋白和基因组结构和功能的不断阐明，相信它们在细胞质内的转运过程及其机制也会被不断揭晓。glycosylation and so on. Finally, these transmembrane proteins are transported to the virion budding site of apical plasma membranes. Cdc42 and Rab11 regulate the transport of NA and M2, respectively. Newly synthesized vRNPs translocate to cytoplasm from the nucleus through CRM1 pathway. Then vRNPs move to recycling endosomes carrying Rab11, and associate with Rab11 vesicles adjacent to the MTOC. The Rab11-vRNP complex is then transported to the virion budding site along the microtubule network.

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