穿琥宁注射液类过敏反应的实验研究

李春英 梁爱华 赵雍 易艳 王云庭，2 李桂琴（中国中医科学院中药研究所，北京00700；2首都医科大学中医药学院，00069）

穿琥宁注射液类过敏反应的实验研究

李春英1梁爱华1赵雍1易艳1王云庭1，2李桂琴1（1中国中医科学院中药研究所，北京100700；2首都医科大学中医药学院，100069）

目的：研究小鼠和大鼠对穿琥宁注射液的类过敏反应，为其临床用药提供参考。方法：①小鼠全身类过敏试验：ICR小鼠随机分组，分别一次性静脉注射生理盐水、Compound 48/80溶液或不同浓度穿琥宁注射液，以上受试物中均含0.4%伊文思蓝。给药后30min记录各组动物耳廓蓝染阳性率，进行耳廓蓝染程度评分，并定量测定耳廓伊文思蓝渗出量。②大鼠皮肤类过敏试验：将大鼠背部和脊柱两侧的毛剃去，经尾静脉注射含0.6%伊文思蓝的生理盐水溶液2m L/kg，10m in后，在麻醉条件下沿脊柱两侧皮内注射受试药，每个点注射50μL。每只鼠均平行设有阴性对照点（生理盐水50μL）和阳性对照点（Compound 48/80 500μg）。20min后，掀开皮肤观察皮肤内蓝斑形成情况，测量蓝斑大小。结果：小鼠静脉注射穿琥宁注射液50、100、200mg/kg（分别相当于临床剂量的1/2、等倍和2倍剂量）均可引起小鼠类过敏反应，表现为耳廓血管通透性增高，耳廓不同程度蓝染；大鼠皮内注射穿琥宁注射液50、100μg，可观察到注射局部明显水肿，形成较大的蓝斑（与阴性对照组比较P<0.05）。结论：穿琥宁注射液对小鼠和大鼠均可引起显著的类过敏反应，提示在临床治疗中具有潜在的类过敏反应的可能。

穿琥宁注射液；类过敏反应；实验研究

穿琥宁注射液主要成分为穿琥宁 （14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯-3，19-二琥珀酸半酯单钾盐），主要用于病毒性肺炎、病毒性上呼吸道感染的治疗。然而，近年来由于穿琥宁注射液导致的药品不良反应不断增多，其不良反应类型以急性过敏样反应为主。从其不良反应发生的时间来看，多数发生在第1次用药过程中或当天[1]，因此推测其不是免疫球蛋白（Ig）E介导的“过敏反应”（Ⅰ型过敏反应），而是“类过敏反应”。已知类过敏反应与Ⅰ型过敏反应的症状类似，但二者发生机制不同。“Ⅰ型过敏反应”需要有致敏过程，使机体产生IgE，再次用药时才发生反应。而“类过敏反应”不需要致敏过程，首次接触药物即发生反应。关于类过敏反应的机制目前并不十分明确[2-3]。本研究利用前期已经建立的类过敏试验动物模型，研究穿琥宁注射液的类过敏反应，为临床安全用药提供参考。

1 材料

1.1 动物

成年健康ICR小鼠，雄性，SPF级，体质量22～25 g，动物合格证号：0249028；成年健康SD大鼠，雌性，SPF级，体质量260～280g，动物合格证号：0243037。以上动物均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 药品和仪器

穿琥宁注射液（天津药业焦作有限公司，规格：2 m L/40 mg，批 号 ：09040341）；Compound 48/80（Sigma公司，批号：40M 4047）；伊文思蓝（EB）（国药集团化学试剂有限公司，批号：WC20070607）；丙酮（北京化工厂，批号：10100407）；生理盐水（石家庄四药有限公司，批号：110507406）；BHM 36Humalyzer 3000半自动生化分析仪（德国）。

2 方法

2.1 小鼠耳血管通透性试验

将小鼠按体质量随机分为5组：阴性对照组、Compound 48/80 25 mg/kg组、穿琥宁注射液50、100、200mg/kg组，每组10只。各组小鼠分别静脉注射给予含0.4%EB不同受试物20 m L/kg，观察给药后30 m in内动物的行为学变化及耳廓蓝染情况。记录每组出现耳廓蓝染的动物数、蓝染总耳数、耳廓蓝染面积。于注射受试物后30 min将动物脱颈椎处死。沿耳根剪下双耳，剪碎，用2 m L丙酮-生理盐水（7∶3）混合浸泡，置于 4℃冰箱浸泡过夜，萃取耳廓内渗出的染料。3 000 r/min离心15 m in，取上清液于610 nm处测吸光度（A）。根据EB标准曲线，计算EB染料渗出量（μg）。根据每组出现耳廓蓝染的动物数计算耳廓蓝染的阳性率（以下简称反应率）：

根据蓝染耳数计算耳蓝染率；根据EB渗出量与对照组比较计算出升高率；耳廓蓝染面积（S）即蓝染面积占耳廓面积的比按照以下标准进行分级：0分： 双耳无蓝染；1分：0＜ S≤1/8；2分：1/8＜S≤1/4；3分 ：1/4＜S≤1/2；4分 ：1/2＜S≤3/4；5分：3/4＜S≤1。

2.2 大鼠皮肤类过敏试验

将大鼠背部和脊柱两侧的毛剃去。经尾静脉注射含0.6%EB的生理盐水溶液2m L/kg。于静脉注射EB后10m in，在腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg使大鼠麻醉的条件下，沿脊柱两侧分别皮内注射阴性对照溶液（生理盐水）、阳性对照溶液（Compound 48/80 500μg）、穿琥宁注射液 25、50、100μg，在每只大鼠上每种受试物分别注射2个点，每个点注射50μL。20 m in后，掀开皮肤观察皮肤内蓝斑形成情况，测量蓝斑大小，直径大于6 mm者判定为阳性。不规则斑点的直径计算方法为长径与短径之和的一半。

3 统计分析

小鼠耳廓EB渗出量以及大鼠蓝斑直径数据均以x±s表示，采用One-Way ANOVA进行分析。每组反应率、耳蓝染率均采用Fisher精确概率法与阴性对照组进行显著性检验；耳廓蓝染面积采用非参数检验。

4 结果

4.1 小鼠全身类过敏反应

从一般情况来看，阴性对照组动物均无异常。穿琥宁注射液200 mg/kg静脉注射给药后，小鼠迅速发生惊厥、跳跃、呼吸困难等严重类过敏症状，辅以胸外按摩得以存活。100 mg/kg组也出现不安、跳跃和呼吸困难症状。50 mg/kg组未见明显行为异常。阳性药（Compound 48/80 25mg/kg）对照组活动减少，未见惊厥、抽搐、呼吸急促或死亡等。

小鼠静脉注射给予阳性药Compound48/80 25 mg/kg后，所有动物均出现双耳不同程度蓝染，反应率和耳蓝染率均达100%，耳廓EB渗出量明显增高，与阴性对照组比较有显著性差异（P<0.001）；穿琥宁注射液 50、100、200 mg/kg组可引起部分动物耳廓蓝染，反应率分别为40%、20%、30%，与对照组比较均有不同程度升高，但无明显剂量关系。对耳廓渗出的EB进行定量分析结果显示，穿琥宁注射液各剂量组与对照组比较均有所升高，其中50 mg/kg组与对照组比较耳廓EB渗出量明显增高（P<0.05）。结果见表1。

表1 穿琥宁注射液致小鼠耳廓血管通透性增高反应（n=10）

4.2 大鼠皮肤类过敏试验

阳性药Compound48/80 500μg组所有注射点均出现大面积蓝斑，蓝斑直径平均达到19.40 cm，明显大于对照组（P<0.001）；穿琥宁注射液 50、100μg组的蓝斑阳性率直径分别为70%、100%，与对照组比较阳性率显著增高（P<0.05，P<0.001），蓝斑直径达到6.40、8.74 cm。与对照组比较均明显增大（P<0.001）。结果见表2。

5 讨论

血管通透性增高是类过敏反应的主要病理机制之一，由于血管通透性增高，血浆渗出到组织间隙，可引起组织水肿，显现出皮肤、黏膜起疹、红肿、瘙痒等；肺组织血管通透性增高及其炎性渗出，可导致咳嗽、喘息、呼吸困难等；严重类过敏反应时，由于大量血浆渗出，血容量下降，同时炎性因子导致毛细血管扩张，可引起血压下降乃至休克等。本实验室曾以血管通透性增高为指征建立注射剂小鼠类过敏反应模型，即在注射剂受试物中加入EB生理盐水溶液，使EB浓度达到0.4%，然后给小鼠静脉注射，由于EB是小分子物质，当其静脉注射入血液后，很快与大分子白蛋白结合，当血管壁完整时，EB不会渗出到血管外，因而动物的耳廓不会出现蓝染。但当血管壁通透性增高时，EB可随着血浆中的白蛋白渗出到血管外，进入组织间隙，使血管外组织蓝染。由于小鼠耳廓的皮肤很薄，耳廓蓝染情况清晰可辨，所以可通过耳廓蓝染发生率和耳廓蓝染面积分级，判断血管通透性增高的程度[4-6]。

表2 穿琥宁注射液致大鼠皮肤蓝染情况（n=10）

大鼠静脉注射给予EB，其与血浆中的白蛋白结合。从背部皮内注射给予不含指示剂的受试物，如果受试物不存在诱导血管通透性增高的作用时（如生理盐水），则在注射部位局部形成蓝色斑点很小（基本上直径＜0.6 cm）。但是，如果皮内注射的受试物具有诱导血管通透性增高的作用时，则注射部位会由于血管通透性增高而导致局部水肿，因而形成较大面积的蓝斑。根据蓝斑直径大小可判断受试物的类过敏反应强度[7]。

一般认为类过敏反应具有剂量关系。在本研究中，穿琥宁注射液引起的小鼠类过敏反应症状与剂量成正比，高剂量组症状最重，中剂量组也有较明显的症状，但比高剂量组轻；低剂量组的症状最轻。然而，从小鼠耳廓血管通透性增高结果看，穿琥宁注射液的反应剂量关系似乎不明显，可能与剂量较高时动物的全身状况较差有关。在大鼠皮肤类过敏试验中，由于是局部给药，并且给药剂量较小，因此对全身的影响不明显，穿琥宁注射液在该试验中显示出与剂量成正比。

本研究结果表明，穿琥宁注射液可引起较严重的类过敏反应，剂量较高时可导致呼吸困难和死亡。穿琥宁注射液的类过敏反应与血管通透性增高有一定关系，小鼠和大鼠实验均可检测出穿琥宁注射液诱导的血管通透性增高。但从小鼠的类过敏严重程度来分析，除了血管通透性增高以外，可能其他病理机制如肺组织气道平滑肌痉挛对穿琥宁注射液的类过敏反应预后也起着重要作用。

在本研究中，穿琥宁注射液有造成小鼠耳廓血管通透性增高以及诱导大鼠皮内血管通透性增高的作用，该研究结果可以解释穿琥宁注射液在临床上的某些“过敏反应”症状，如皮肤起疹、瘙痒等。另外，根据实验结果可知，剂量越高反应越重，甚至可危及生命，提示临床上应严格控制用药剂量，不可盲目加量。

类过敏反应的机制并不十分清楚，目前认为类过敏反应主要是由直接刺激肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺和类胰蛋白酶等或激活补体从而释放上述生物活性物质这两条主要途径造成，而不是由经典的免疫途径介导[8-9]。有关穿琥宁注射液的类过敏反应机制有待将来进一步研究。

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[2]马宏图，睢凤英.中药注射剂安全性与类过敏反应[J].中国医院药学杂志，2009，29（10）：838-840.

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The Experimental Study on Anaphylactoid Reactions of Potassium Dehydroandrograpolide Succinate Injection

LiChunying1， Liang Aihua1， Zhao Yong1， YiYan1， Wang Yunting1，2， LiGuiqin1（1 Institute of Chinese Material Medica of China Academy of Chinese Medicine Sciences，Beijing 100700，China;2 School of Traditional Chinese Medicine of Capital Medical University， 100069）

Objective:To investigate the anaphylactoid reactions of potassium dehydroandrograpolide succinate injection（PDSI） inm ice and rats so as to provide a scientific guidance for its clinical therapy.Methods:①Anaphylactoid reaction test in m ice:ICR m ice were random ly assigned to receive intravenously physiological saline，compound 48/80 solution or different concentrations of PDSI respectively， containing 0.4%Evans blue（EB） .Thirty minutes later， the auricle aizen positive rate of each animal was recorded，the auricle aizen degree score and the quantitative determination of auricle EB seepage quantity were made.②Cutaneous anaphylaxis test in rats：rats were given physiological saline solution containing 0.6%EB by tail vein intravenous injection.Ten minutes later， 50μL solutions of PDSI in different concentrations were given to anesthetized rats by intra dermal injection on both sides of spine.Each rat is parallel with negative control point（physiological saline 50μL） and positive control point（compound 48/80 500μg）.Twenty minutes later，blue plaque in skin was measured and the absorbance of EB extraction of skin was quantitative determined.Results:The study of anaphylactoid reaction test in mice showed that all three doses of PDSI（50，100 and 200mg/kg，equivalent respectively to 1/2， 1 and 2 times of clinical doses） induced anaphylactoid reactions， as the vascular permeability increased and ear blue stained at different extent.The study of cutaneous anaphylaxis test in rats showed that PDSIata dose of 50 and 100mg/kg can induce edema at the injection site and form a larger locus blue plaque（vs.the negative control group， P<0.05）.Conclusion:It was proved thatanaphylactoid reactions can be induced evidently by PDSIboth in mice and rats，indicating that anaphylactoid reactions may happen in clinical therapy.

Potassium Dehydroandrograpolide Succinate Injection；Anaphylactoid Reaction；Experimental Study

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.12.009

国家自然科学基金（90709043），国家科技支撑计划项目（2006BAI14B05），国家科技重大专项（2009ZX09301-005，2009ZX09502-001）

李春英，女，助理研究员。研究方向：中药药理与毒理研究。E-mail:lcy121858@sina.com

梁爱华，女，博士，研究员，博士生导师。研究方向：中药安全性评价、中药毒性及其机理研究、中药抗肿瘤、抗炎、免疫和内分泌调节作用及其作用机制研究。通讯作者E-mail:liangaihua@sina.com

2012-10-08）