动脉粥样硬化患者基质金属蛋白酶-9及其抑制物-1基因表达与痰浊证素的相关性研究*

谈晓东 苏 伟 高 枫 周春刚 陆 曙

（南京中医药大学无锡附属医院 无锡市中医医院，江苏 无锡 214001）

动脉粥样硬化（AS）是具有慢性炎症反应特征的病理过程，其发展始终伴随炎症反应。AS的形成是动脉对内膜损伤做出的炎症-纤维增生性反应的结果。有研究认为循环血液中基质金属蛋白酶－9（MMP-9）与基质金属蛋白酶抑制物－1（TIMP-1）水平可作为反映AS严重程度的良好指标［1］。笔者就AS痰浊证素与MMP-9及TIMP-1的关系进行了研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年6月至2010年2月南京中医药大学无锡附属医院（无锡市中医医院）心血管科AS住院患者78例，男性32例，女性46例；年龄（69.91±10.94）岁，痰浊证素30例，非痰浊证素48例。另从本院体检中心匹配年龄与性别，选取60例健康人作为健康对照组。中医证素的辨证结合2002年卫生部《中药新药治疗高血压病的临床研究指导原则》［2］和《中药新药治疗胸痹（冠心病心绞痛）临床研究指导原则》［2］、《中医诊断学》［3］相关内容，确定 AS 患者的中医“证素”诊断标准。由同一位具有多年临床经验的主任中医师对该部分患者运用中医望、闻、问、切四诊，进行中医证素评估，准确、全面收集证素。

1.2 MMP-9及TIMP-1基因表达的测定方法 （1）全血总RNA抽提。取入组者晨空腹血2 mL，经EDTA-2Na抗凝，0.3 mL全血采用3S柱离心式血液总RNA抽提试剂盒（K3620上海博彩生物科技有限公司）抽提RNA，RNA提取物-80℃保存。（2）MMP-9及TIMP-1 mRNA表达水平测定。通过实时荧光定量PCR技术进行相对定量检测。全血总RNA合成cDNA使用TAKARA反转录反应试剂盒（DRR037S大连宝生物工程有限公司）。实时荧光定量PCR反应体系为20μL，包括2×SYBRRPremix Ex Taq TM，1~100 ng cDNA，50 pmol/μL引物。两步法PCR循环条件：预变性95℃ 30 s 1个循环，变性95℃ 5 s，退火/延伸 60℃ 20 s共 40个循环。 溶解曲线分析95℃ 1 s，65℃ 15 s，95℃ 1 s。

1.3 相对定量分析 相对定量分析采用Light Cycler Relative Quantification（Version1.5）软件，标准化比值计算公式采用2-△△CT法，△CT （患者样本）=CT目的基因-CT内参基因，△CT（校正品）=CT目的基因-CT内参基因，△△CT=△CT（患者样本）-△CT（校正品）。

1.4 统计学处理 所有数据采SPSS17.0软件包进行统计分析。计量资料以）标准差表示；经正态性检验主要观察指标均符合正态分布。计量指标两组间、组内比较采用student-t双尾检验；多组计量指标均数间比较，方差齐时采用单因素方差分析，方差不齐时，采用多个独立样本非参数K－S秩和检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MMP-9及TIMP-1基因片段电泳结果 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，结果显示：对照组与实验组的内参基因GAPDH的片段大小为94 bp左右，TIMP-1基因片段的大小为102 bp左右，MMP-9基因片段的大小为108 bp左右。如图1。

图1 MMP-9、TIMP-1及GAPDH基因片段电泳图

2.2 MMP-9、TIMP-1和GAPDH基因扩增产物溶解曲线 （Tm） 分析溶解曲线显示MMP-9、TIMP-1和GAPDH的PCR产物均具有一明显而尖峭的峰，其溶解温度 MMP-9为 86.40℃，TIMP-1为 87.10℃，GAPDH为87.80℃。峰溶解温度为77℃的曲线为未加模板的阴性对照样本，具有一个弱而宽的峰，说明此峰为引物二聚体。峰图说明MMP-9、TIMP-1和GAPDH特异性PCR产物形成固定溶解温度的曲线峰，当反应中含有诸如引物二聚体之类的非特异性副产物时，溶解曲线可能出现两个峰。见图2。

2.3 MMP-9及TIMP-1基因片段的测序结果 RT-PCR产物经TA克隆，送南京金斯瑞生物科技公司测序，经比对，该两种基因与GENBANK上人MMP-9 mRNA（GenBank：NM_004994.2）与 TIMP-1 mRNA（Gen Bank：NM_003254.2）基因片段完全一致。结果见图3、4。

图2 MMP-9、TIMP-1和GAPDH基因扩增产物溶解曲线（Tm）图

图3 MMP-9基因片段序列图

图4 TIMP-1基因片段序列图

2.4 痰浊证素与非痰浊证素组MMP-9、TIMP-1基因表达水平指标比较 痰浊证素组MMP-9基因表达水平大于非痰浊证素组，且差异有统计学意义（t=2.418，P＜0.05）；痰浊证素组TIMP-1基因表达水平大于非痰浊证素组，且差异有统计学意义（t=2.180，P＜0.05）。 见表 1。

表1 两组MMP-9、TIMP-1基因表达水平比较

表1 两组MMP-9、TIMP-1基因表达水平比较

与痰浊证素组比较，△P＜0.05。

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3 讨 论

运用证素进行组合辨证，都有助于摒弃纷繁复杂的表象的干扰，直接把握疾病本质，提高中医辨证论治的可操作性、准确性，对临床诊治具有很大指导意义。目前发现，AS的发生、发展与MMP-9及TIMP-1基因表达水平有着重要的关系［4］。因此，监测血清MMP-9、TIMP-1的基因表达水平可用于预测AS发生、发展，有利于及早采取临床干预降低死亡率及改善预后。

目前认为，患者先天禀赋不足，阳无以化气，阴无以成形，导致膏脂过多，渗入血中，发生高脂血症而致AS。AS患者多为老年患者，肾虚不能化气行水，水泛而为痰；肺气不足，肺失宣降，津液不得通调输布，津液留聚而生痰。无锡地处长江以南，依山傍水，气候宜人，居民喜食甜腻之品，易碍脾伤胃，故AS的证素分布多以痰浊偏多。

现代研究认为，“痰浊”与高脂血症和高凝状态相关［5］，而脂质代谢紊乱是AS形成的重要因素，AS患者中合并脂质代谢异常的比例较高。一般认为，痰浊是高脂血症的基本病机，而血浆化学成分改变可引起血浆黏度增高，并能直接影响AS的发生。血脂代谢紊乱等病理因素导致的血管硬化、管腔狭窄，加上血液的流变性异常，血流缓慢，造成组织器官供血不足而缺血缺氧，代谢产物堆积，有可能是痰浊作为中医病理产物在脑动脉硬化过程中发生作用的病理机制之一［6］。脂代谢异常等可以造成血管内皮细胞的功能与结构损伤，血管壁发生慢性炎症，受到致病原侵袭的血管内皮细胞表达黏附分子，吸引大量炎症细胞移行进入内皮层下，单核细胞转化为巨噬细胞，后吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫细胞，启动了AS过程。泡沫细胞不断分泌释放包括MMPs在内的各种细胞因子，促进AS的发生发展。

本研究显示，AS痰浊证素组的MMP-9基因表达水平明显大于非痰浊证素组，提示AS不同证素有着共同的病理变化，加强对MMP-9的临床研究在心血管疾病的防治中有其特殊意义，可将MMP-9基因水平检测作为AS病情发展的一种监测指标和AS中医辨证分型的客观指标。而痰浊证素组的TIMP-1基因表达水平明显大于非痰浊证素组，这个结论同样也可以支持这一观点。TIMP-1基因表达水平可反映AS的严重程度，其值随证素的演变而变化。因此，TIMP-1基因表达水平可作为中医痰浊证素的客观指标。

［1］ Pradhan AD，Ridker PM.Do atherosclerosis and type 2 diabetes shares a common inflammatory basis［J］.Eur Heart J，2002，23（6）：831.

［2］ 中华人民共和国卫生部.中药新药临床研究指导原则（第1 辑）［S］.1993.

［3］ 陈文彬.中医诊断学［M］.5版.北京：人民卫生出版社，2001：341－342.

［4］ Faia KL，Davis WP，Marone AJ，et al. Matrixmetalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in hamster aortic atherosclerosis：correlation with insituzymography［J］. Atherosclerosis，2002，160（2）：325-330.

［5］ 程小曲.痰浊型冠心病与血脂、脂蛋白、载脂蛋白的关系及痰浊形成机理的探讨［J］.新中医，1994，26（3）：7-9.

［6］ 陈文强，李宗信，黄小波，等.影响脑动脉硬化患者痰证的多因素分析［J］.中国老年学杂志，2006，26（12）：1618-1619.