脊髓损伤后大鼠行为学改变及早期腓肠肌的变化

宋伟，蒲放

脊髓损伤后大鼠行为学改变及早期腓肠肌的变化

宋伟1,2，蒲放3

目的 探索脊髓损伤后大鼠行为学改变及早期腓肠肌变化。方法108只Wistar大鼠，其中38只为假手术组(n=38)，其余制作脊髓切除模型，分为损伤组(n=38)和康复训练组(n=32)。应用BBB法评价大鼠脊髓损伤后不同时间点的行为学变化；通过免疫组织化学法观察腓肠肌的变化。结果康复训练组BBB评分从术后3周开始高于损伤组，但两组得分始终未超过10分。Dystrophin免疫荧光染色显示，脊髓损伤后损伤组和康复训练组腓肠肌肌纤维横截面积均减小，但康复训练组萎缩程度较轻。结论脊髓损伤后大鼠后肢运动功能可出现一定的自发性恢复，康复训练有利于脊髓损伤大鼠运动功能的恢复，并能减缓后肢肌肉萎缩。

脊髓损伤；康复训练；肌肉

脊髓损伤是造成瘫痪的主要原因。目前临床尚无有效的治疗办法。一般认为，哺乳动物(包括人在内)都是通过脊髓中枢模式发生器(central pattern generator,CPG)[1]控制步行运动，它诱导腿部执行左右交替的步态，其所构成的网络可使脊髓在完全失去下行运动支配和上行感觉传入的情况下产生一些节律性运动，如游泳、行走、搔扒等，这些网络的功能同时也可受上级中枢的支配及感觉传入的调节，由于CPG网络的边界是灵活的，脊髓损伤后脊髓步行CPG可实现网络重组。研究显示，减重步行平板训练(BWSTT)可使脊髓横断面完全恢复后肢步行能力。临床也发现，脊髓损伤患者可通过BWSTT提高步行能力，表明脊髓可能具有运动学习的能力[2]。康复训练可以使CPG得到更好地引发和加强，进而使脊髓损伤患者或模型动物运动功能得到更大程度的恢复。

本实验旨在通过制作大鼠切割型脊髓损伤模型，在术后对切割模型动物进行康复训练的情况下，使用BBB法对不同时间点大鼠的行为学变化进行评价，采用免疫组织化学技术，研究大鼠脊髓损伤及康复训练后肌肉组织的病理变化，并对脊髓损伤及被动康复训练后早期肌肉组织的反应性变化进行分析，拟为脊髓损伤后的康复训练提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 Wistar成年大鼠108只，雌性，体重230～250 g，SPF级，首都医科大学动物科学部提供。

1.2 方法

1.2.1 脊髓损伤模型制备 室温条件下，6%水合氯醛腹腔内注射麻醉(30 mg/kg体重)，常规备皮，固定于鼠板，外科消毒，铺无菌巾；沿背正中线切开背部皮肤，锐性分离筋膜、椎旁肌肉，咬除T7椎板，暴露T9脊髓节段，在手术显微镜下，沿脊髓后正中线剪开硬脊膜，并固定在临近肌肉组织上，使用显微外科剪将一段长约3 mm脊髓全部切除，然后用吸引器于软膜下吸断未横断的脊髓组织，确认此段无组织残留[4]。

1.2.2 假手术组 同法暴露T9段脊髓而不造成脊髓损伤。

1.2.3 实验动物分组 假手术组(n=38)，模型动物分为损伤组(n=38)和康复训练组(n=32)。

1.2.4 实验动物存活时间 1周、2周、4周、8周、10周、20周、30周、50周。

1.2.5 脊髓损伤大鼠BBB开放空间运动评分法 实验大鼠经造模后每周采用双人双盲法进行后肢行为学评价，将动物放置于直径为2 m的圆形平台上，观察记录其后肢的行走及肢体活动。评分包括三部分：第一部分为0～7分，评判动物后肢各关节运动及活动度；第二部分为8～13分，评判后肢的步态及前后肢协调功能；第三部分为14～21分，评判运动中足、趾及尾巴的精细动作，3项满分为21分[3]。

1.2.6 康复训练

1.2.6.1 急性不稳定期(术后2～4周) 为防止脊柱损伤后稳定性被破坏，以基本护理为主：①每天人工排尿4次；②下肢被动活动(关节活动度运动和肌肉按摩训练)：每次5 min，每周5次。

1.2.6.2 急性稳定期(术后5～8周) 脊柱稳定性已恢复，损伤水平和程度基本确定：①下肢被动活动(同上)；②倾斜栅格爬行训练：每次5 min，每周5次；③滚筒式转笼：每次5 min，每周5次；④感觉刺激：使用针灸针扎大鼠后肢或尾部，配合栅格爬行训练。

1.2.7 Dystrophin免疫荧光染色 将各组动物分别于手术后1周、2周、4周、8周进行心脏灌杀固定，取脊髓损伤术后1周、2周、4周、8周大鼠的后肢腓肠肌，横行连续冰冻切片，切片厚度：10 μm。使用0.1 M PBST浸洗切片2次，每次10 min；1N盐酸修复抗原，室温30 min；0.1 M PBST浸洗3遍，共10 min；4%H2O2清除内源性过氧化物酶，室温15 min；0.1 M PBST浸洗切片3次，共10 min；5%山羊血清室温孵育30 min，封闭非特异性抗原；小鼠来源抗大鼠Dystrophin单克隆抗体(1∶1000)，4℃，过夜；0.1 M PBS浸洗3遍，每次10 min；FITC标记羊抗小鼠IgG(1∶200)；室温孵育2 h；0.1 M PBS浸洗3遍，每次10 min；30%甘油PB封片，荧光显微镜观察。

1.3 统计学分析 荧光显微镜下观察并照相，应用Leica Qwin图像分析系统进行各组动物肌纤维横截面积测量，SPSS 11.5统计软件进行独立样本t检验，相同时间点的组间比较采用单因素方差分析，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 BBB评分比较 评分采用双人双盲法对大鼠左右后肢分别进行评价，然后取其均值。图1显示，损伤组和康复训练组大鼠仍存在后肢运动功能的自发性恢复，康复训练组大鼠BBB评分从术后3周开始高于损伤组，但两组得分始终未超过10分，尚不能达到频繁或持续负重的步行能力。

图1 各组大鼠各时间点BBB评分比较

2.2 术后不同时间大鼠后肢腓肠肌肌纤维直径变化

正常大鼠腓肠肌横截面Dystrophin免疫荧光染色并用Heochst33342复染肌细胞核。荧光显微镜下显示，腓肠肌肌纤维横截面形态规则，肌细胞核紧贴于肌纤维的边缘。损伤组肌纤维横截面积显著减小，康复训练组随时间的延长也有不同程度的萎缩，但程度较轻。

应用Leica Qwin图像分析系统测量大鼠肌纤维横截面积，发现损伤组术后1周肌纤维横截面积开始减小，与正常时相比有统计学差异(P＜0.05)；术后2周和4周，两组肌纤维横截面积继续下降，且损伤组下降更为明显，4周时损伤组与假手术组、康复训练组相比均有显著性差异(P＜0.01)；术后10周康复训练组与假手术组相比横截面积也发生明显减少，且有显著性差异(P＜0.01)。见图2。

图2 大鼠术后不同时间各组后肢腓肠肌肌纤维横截面积比较

3 讨论

通过行为学评价发现，由于CPG的存在，在大鼠胸髓完全横断未接受任何干预措施的情况下，仍存在后肢运动功能的自发性恢复，损伤组大鼠经组织学观察也表明其损伤处主要为瘢痕组织，无轴索结构，虽然镀银染色和NF免疫组化染色表明有神经纤维存在，但零星且结构散乱，并无传导功能。进而表明，脊髓完全横断后的后肢运动功能恢复是损伤远段脊髓的自主功能所致，与损伤处是否有功能性修复或残留纤维代偿无关。

脊髓损伤后骨骼肌因为神经营养作用的丧失及自身废用而发生萎缩，并伴有结缔组织的增生，这种改变将随时间的延长而呈现进行性加重，Dystrophin是一巨大杆状蛋白(427 kDa)，位于骨胳肌与心肌细胞膜内侧面，其功能由4个结构区域实现，包括N端区、中央杆状区、C端的Cysteine-rich(CR)区及C端区；它由Dystrophin相关蛋白(Dystrophin-associated protein,DAP)复合物锚定在胞膜上；中间杆状区由24个杆状重复和4个绞链区组成[5]。跨膜结构Dystrophin起着稳定肌细胞膜和细胞骨架作用。通过对腓肠肌横截面进行Dystrophin免疫荧光染色可显示腓肠肌的肌纤维膜。我们发现，正常腓肠肌肌纤维横截面积较大，形态规则，肌细胞核紧贴于肌纤维的边缘；损伤组肌纤维横截面积显著减小，康复训练组随时间的延长也有不同程度的萎缩，但程度相对较轻。

本研究结果显示，大鼠脊髓损伤后由于CPG的存在，后肢运动功能可出现一定的自发性恢复。康复训练有助于脊髓损伤大鼠行为学的恢复，并能减缓后肢腓肠肌萎缩程度。

[1]Marder E,Bucher D.Central pattern generators and the control of rhythmic movements[J].Curr Biol,2001,11:986-996.

[2]Wernig A,Müller S.Laufband locomotion with body weight support improved walking in persons with severe spinal cord injuries[J].Paraplegia,1992,30(4):229-238.

[3]Arshavsky Y,Orlovsky GN,Panchin YV,et al.Neuronal control of swimming locomotion:analysis of the pteropod mollusc clione and embryos of the amphibian Xenopus[J].Trends Neurosci,1993,16(4):227-233.

[4]欧喜超,杨朝阳,刘玉军,等.大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复及前角运动神经元功能的改变[J].中国康复理论与实践,2008,14(3):231-233.

[5]Pearson KG.Common principles of motor control in vertebrates and invertebrates[J].Ann Rev Neurosci,1993,16:265-297.

Change of Ethology and Gastronomies of Rats after Spinal Cord Injury

SONG Wei,PU Fang.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China

ObjectiveTo explore the alteration in ethology and change of muscle fibers of gastronomies of rats following spinal cord injury(SCI).Methods108 Wistar rats were divided into sham operation group(n=38)and SCI group(n=38)and rehabilitation group(n=32).The ethology was evaluated by Basso,Beattie,and Bresnahan Locomotor Rating Scale(BBB Scale),and the alteration of muscle tissue's reactivity was observed by immunohistochemistry staining.ResultsThe BBB scores of rehabilitation group were higher than SCI group 3 weeks after injury,but all was lower than 10.The cross section areas of gastrocnemius in both groups were getting smaller,but the rehabilitation group was slighter.ConclusionSpontaneous recovery occurred in some degree for rats'hind limb after spinal cord injury.Rehabilitation training is beneficial for the recovery of rats'motor function,and alleviates the atrophy of hind limb after spinal cord injury.

spinal cord injury;rehabilitation training;muscle

[本文著录格式]宋伟，蒲放.脊髓损伤后大鼠行为学改变及早期腓肠肌的变化[J].中国康复理论与实践,2012,18(6):548-550.

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.06.014

1.首都医科大学康复医学院，北京市100068；2.中国康复研究中心康复工程研究所，北京市100068；3.北京航空航天大学生物医学工程学院，北京市100191。作者简介：宋伟(1963-)，女，吉林四平市人，高级工程师，主要研究方向：生物医学工程、康复工程。

R651.2

A

1006-9771(2012)06-0548-03

2011-08-04)

·临床研究·