柱前衍生HPLC测定阿胶中17种水解氨基酸含量

谢 谊 ，易 艳 ，刘 阳 ，3，彭一波 ，3，王实强 *

（1.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙 410013；2.湖南省娄底市中心医院，湖南 娄底 417000；3.湖南中医药大学2009级研究生班，湖南 长沙 410208）

柱前衍生HPLC测定阿胶中17种水解氨基酸含量

谢 谊1，易 艳2，刘 阳1，3，彭一波1，3，王实强1*

（1.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙 410013；2.湖南省娄底市中心医院，湖南 娄底 417000；3.湖南中医药大学2009级研究生班，湖南 长沙 410208）

目的 建立柱前衍生高效液相色谱法（HPLC）同时测定阿胶中17种水解氨基酸含量的方法。方法 用6 mol/L盐酸溶液水解阿胶中的氨基酸，以异硫氰酸苯酯为柱前衍生试剂；用Hypersil BDS C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为30℃。结果 17种氨基酸在60 min内均可得到很好的分离，回收率为97.4%～100.1%，RSD为1.6%～3.4%。结论 建立的方法可靠，可用于阿胶中17种水解氨基酸的含量测定。

阿胶；氨基酸；酸水解；柱前衍生高效液相色谱法

阿胶始载于《神农本草经》，是马科动物驴或其他驴的皮去毛后熬制而成的胶块[1]，有“补血圣药”的美称。阿胶多由骨胶原组成，其水解可得明胶，蛋白质和多种氨基酸，共含18种氨基酸[2]。大多数氨基酸不含芳香环等生色团，不能直接用紫外法检测，需将氨基酸衍生为具有较强紫外吸收或发荧光的衍生物进行检测。本文选用异硫氰酸苯酯[3-5]作为柱前衍生试剂，因其与一、二级氨基酸可同时反应；衍生产物（苯氨基硫甲酰衍生物）单一、稳定，衍生副产物对测定无干扰；采用常用的C18柱，用高效液相色谱法测定阿胶中17种水解氨基酸的含量，现报道如下。

1 实验材料

1.1 仪器

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外可见检测器，N2000数据工作站，KQ2200B型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)，AE240分析天平(METTLER)。

1.2 试药

阿胶样品(湖南长沙、湖南株洲、河南)；L-谷氨酸对照品（140690-200401）、L-羟脯氨酸对照品（111578-200201）、甘氨酸对照品（110735-200102）、L-丙氨酸对照品（140680-200401）、L-精氨酸对照品（140685-200802）、L-脯氨酸对照品（140677-200405）均为中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；其他11种氨基酸对照品均为生化试剂，大部分未标明纯度（L-天冬氨酸为天津市科密欧化学试剂有限公司提供；L-组氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸为国药集团化学试剂有限公司提供；L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸为天津市光复精细化工研究所提供）；乙腈为色谱纯；异硫氰酸苯酯及其他试剂均为分析纯。

图1 17种氨基酸对照品（A）和阿胶供试品衍生物（B）的HPLC图

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱：HypersilBDSC18柱(200mm×4.6 mm，5μm)，流动相：以乙腈-0.1 mol/L 乙酸钠溶液（3∶97）为流动相 A（用乙酸调节 pH 6.5）、以乙腈-水（4∶1）为流动相 B，按表 1进行梯度洗脱，流速：1.0 mL/min，检测波长：254 nm，柱温：30℃。

表1 梯度洗脱程序 （%）

在选定的色谱条件下测定17种氨基酸衍生物峰与其它相邻峰分离度均大于1.5；按L-羟脯氨酸衍生物峰计算，理论板数在4 000以上。17种氨基酸对照品和供试品衍生物的高效液相色谱图见图1。

2.2 6种氨基酸对照品贮备液的制备

分别精密称取6种氨基酸对照品，加0.1 mol/L盐酸制成每1 mL分别含L-谷氨酸0.338 mg、L-羟脯氨酸 0.356 mg、 甘氨酸 0.762 mg、L-丙氨酸0.324 mg、L-精氨酸 0.236 mg、L-脯氨酸 0.506 mg的混合对照品贮备液。

2.3 17种氨基酸混合对照品溶液和供试品溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备 精密称取L-天冬氨酸等17种氨基酸对照品于量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液配制成每1 mL分别含L-天冬氨酸43.2μg、L- 谷氨酸73.1μg、L- 羟脯氨酸86.4μg、L-丝氨酸 26.8μg、甘氨酸 160.9μg、L-组氨酸6.4μg、L-苏氨酸 15.6μg、L-丙氨酸64.8μg、L-精氨酸 59.3μg、L-脯氨酸 93.9μg、L-酪氨酸 7.2μg、L-缬氨酸 21.2μg、L-甲硫氨酸12.4μg、L- 异亮氨酸12.8μg、L- 亮 氨 酸28.0μg、L-苯丙氨酸 15.6μg、L-赖氨酸 31.2μg的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备[6]将阿胶样品研磨成粉后，取0.1 g于安瓿瓶中，精密称定，加6 mol/L盐酸5 mL，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30 min使其溶解，150℃水解1 h，放冷，移入蒸发皿中，用10 mL水分次洗涤安瓿瓶，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干。残渣加0.1 mol/L盐酸溶解，转移至100 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 异硫氰酸苯酯衍生化物的制备 取上述17种氨基酸混合对照品溶液和供试品溶液各2 mL，分别置10 mL离心管中，加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液1.0 mL，1 mol/L三乙胺乙腈溶液1.0 mL，漩涡混合1 min，放置1 h后，加入4 mL正已烷，漩涡混合1 min后，放置10 min，取下层溶液，滤过，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取L-谷氨酸等6种混合氨基酸对照品贮备液 1、2、3、4、5、6 mL， 分别置于 10 mL 量瓶中，用0.1 mol/L盐酸加至刻度，摇匀。按“2.3.3”项下衍生化处理后，分别吸取上述溶液5 μL注入液相色谱仪中，测定峰面积积分值，以进样量（μg）为横坐标，相应峰面积积分值（mv）为纵坐标，绘制标准曲线，得6种氨基酸的回归方程、相关系数及线性范围，结果见表2。

表2 L-谷氨酸等6种氨基酸的线性关系考察

2.5 精密度试验

取阿胶（长沙1批）依“2.3”法制备供试品溶液，每次进样5 μL，重复进样6次，测定L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的峰面积积分值，结果RSD分别为1.7%、1.9%、1.9%、1.4%、1.8%及1.7%，表明本方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

取阿胶（长沙1批）依“2.3”法制备供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样 5 μL， 测定 L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的峰面积，结果RSD分别为1.5%、1.8%、1.5%、0.9%、1.4%及1.7%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取阿胶（长沙1批）依“2.3”法制备供试品溶液共6份，测定样品中L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸含量，RSD分别为1.6%、1.5%、1.7%、1.8%、1.7%及1.6%，表明本方法重复性好。

2.8 加样回收试验

取阿胶（长沙1批）适量，研细，取约0.05 g，共6份，精密称定，分别精密加入适量的L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，经衍生化后测定各氨基酸的含量，计算回收率。得L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的回收率（RSD）分别为 97.7%（3.4%）、99.3%（3.3%）、100.1%（2.8%）、97.4%（2.7%）、97.5%（3.2%）及 99.3%（1.6%）。结果表明6种氨基酸回收率较好。

2.9 样品测定

按“2.3”项下方法制备各阿胶样品的供试品溶液，按“2.1”色谱条件下进样测定，用峰面积按外标法定量计算，结果见表3。

表3 10批阿胶样品17种氨基酸含量测定结果 （n=2，%）

3 讨论

流动相的选择中，参考了2010版《中国药典》一部阿胶质量标准中的流动相系统，但梯度的设计比《中国药典》标准更精密，使17种氨基酸得到很好的分离，药典标准中只测定了其中4种氨基酸的含量，本方法操作简便，结果基本可靠，能更全面反映阿胶中水解氨基酸的组成及含量，可作为阿胶质量控制的依据。

阿胶水解氨基酸的制备中，考察了130℃水解5 h和150℃水解1 h，结果发现两者所测得的氨基酸含量差别不大，说明都已经水解完全，所以选用150℃水解1 h。

本实验对10批阿胶的水解氨基酸组成及含量进行了分析，虽然文献报道阿胶含有18种氨基酸，但在实际检测中，未检测出胱氨酸，故共测定了其中的17种氨基酸含量且总含量大于80%（82.4%～96.8%）。由于对照品的原因，只做了中检所提供的6种氨基酸的线性关系考察和回收率试验，结果可靠，其他11种氨基酸的含量测定结果也具参考价值。

[1]宋立人，洪 恂，丁绪亮，等.现代中药学大辞典［M］.北京：人民卫生出版社，2001∶1 118

[2]陈定一，王静竹，刘文林.阿胶及其炮制品中氨基酸和微量元素的分析研究［J］.中国中药杂志，1991，16（2）：833-835.

[3]宋志峰，王 丽，纪 锋，等.氨基酸分析中的柱前衍生技术［J］.吉林农业科学，2004，29（6）：54-58.

[4]胡建鸿，邱 利，王成润，等.柱前衍生反相高效液相色谱法同时测定保健饮品中16种氨基酸［J］.食品科技，2008(10):211-214.

[5]杨 菁，孙黎光，白秀珍，等.异硫氰酸苯酯柱前衍生化高效液相色谱法同时测定 18 种氨基酸［J］.色谱，2002，20（4）:369-371.

[6]程显隆，肖新月，邹秦文，等.柱前衍生化HPLC法同时测定阿胶中4 种主要氨基酸的含量［J］.药物分析杂志，2008（12）:1 997-2 000.

（本文编辑 杨 瑛）

Determination of 17 kinds of hydrolyzed amino acids content in donkey-hide glue by HPLC with pre-column derivatization

XIE Yi,YI Yang,LIU Yang,PENG Yi-bo,WANG Shi-qiang
(Institute of Chinese Materia Medica,TCM Academy of Hunan,Changsha,Hunan 410013,China)

Objective To determine the contents of 17 kinds of hydrolyzed amino acids in donkey-hide glue by HPLC with pre-column derivatization at the same time.Methods To extract amino acids by the method of hydrolysis in 6 mol/L HCl and use phenylisothiocyanate(PITC)as the derivating agent.The Hypersil BDS C18column(200 mm×4.6 mm,5 μm)was used.Under the condition of gradient elution,the flow rate was 1.0 mL/min,the UV detection wavelength was 254 nm,and the column temperature was 30℃.Results 17 kinds of amino acids can be separated well in 60 min.The average recoveries were 97.4%～100.1%and RSD were 1.6%～3.4%.Conclusion The method is reliable for the determination of 17 kinds of amino acids in donkey-hide glue.

donkey-hide glue;17 kinds of amino acids;acid hydrolysis;HPLC with pre-column derivatization

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2012.05.011.046.04

2011-10-19

谢 谊（1974-），女，白族，湖南怀化人，助理研究员，硕士，主要从事中药制剂分析工作。

* 王实强，男，研究员，E-mail：wsq8135@163.com。