柱前衍生HPLC测定阿胶中17种水解氨基酸含量

2012-01-29 08:01彭一波王实强
湖南中医药大学学报 2012年5期
关键词:羟脯氨酸精氨酸阿胶

谢 谊 ,易 艳 ,刘 阳 ,3,彭一波 ,3,王实强 *

(1.湖南省中医药研究院中药研究所,湖南 长沙 410013;2.湖南省娄底市中心医院,湖南 娄底 417000;3.湖南中医药大学2009级研究生班,湖南 长沙 410208)

柱前衍生HPLC测定阿胶中17种水解氨基酸含量

谢 谊1,易 艳2,刘 阳1,3,彭一波1,3,王实强1*

(1.湖南省中医药研究院中药研究所,湖南 长沙 410013;2.湖南省娄底市中心医院,湖南 娄底 417000;3.湖南中医药大学2009级研究生班,湖南 长沙 410208)

目的 建立柱前衍生高效液相色谱法(HPLC)同时测定阿胶中17种水解氨基酸含量的方法。方法 用6 mol/L盐酸溶液水解阿胶中的氨基酸,以异硫氰酸苯酯为柱前衍生试剂;用Hypersil BDS C18柱(200 mm×4.6 mm,5 μm),梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,检测波长为254 nm,柱温为30℃。结果 17种氨基酸在60 min内均可得到很好的分离,回收率为97.4%~100.1%,RSD为1.6%~3.4%。结论 建立的方法可靠,可用于阿胶中17种水解氨基酸的含量测定。

阿胶;氨基酸;酸水解;柱前衍生高效液相色谱法

阿胶始载于《神农本草经》,是马科动物驴或其他驴的皮去毛后熬制而成的胶块[1],有“补血圣药”的美称。阿胶多由骨胶原组成,其水解可得明胶,蛋白质和多种氨基酸,共含18种氨基酸[2]。大多数氨基酸不含芳香环等生色团,不能直接用紫外法检测,需将氨基酸衍生为具有较强紫外吸收或发荧光的衍生物进行检测。本文选用异硫氰酸苯酯[3-5]作为柱前衍生试剂,因其与一、二级氨基酸可同时反应;衍生产物(苯氨基硫甲酰衍生物)单一、稳定,衍生副产物对测定无干扰;采用常用的C18柱,用高效液相色谱法测定阿胶中17种水解氨基酸的含量,现报道如下。

1 实验材料

1.1 仪器

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪,SPD-10Avp紫外可见检测器,N2000数据工作站,KQ2200B型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司),AE240分析天平(METTLER)。

1.2 试药

阿胶样品(湖南长沙、湖南株洲、河南);L-谷氨酸对照品(140690-200401)、L-羟脯氨酸对照品(111578-200201)、甘氨酸对照品(110735-200102)、L-丙氨酸对照品(140680-200401)、L-精氨酸对照品(140685-200802)、L-脯氨酸对照品(140677-200405)均为中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用;其他11种氨基酸对照品均为生化试剂,大部分未标明纯度(L-天冬氨酸为天津市科密欧化学试剂有限公司提供;L-组氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸为国药集团化学试剂有限公司提供;L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸为天津市光复精细化工研究所提供);乙腈为色谱纯;异硫氰酸苯酯及其他试剂均为分析纯。

图1 17种氨基酸对照品(A)和阿胶供试品衍生物(B)的HPLC图

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱:HypersilBDSC18柱(200mm×4.6 mm,5μm),流动相:以乙腈-0.1 mol/L 乙酸钠溶液(3∶97)为流动相 A(用乙酸调节 pH 6.5)、以乙腈-水(4∶1)为流动相 B,按表 1进行梯度洗脱,流速:1.0 mL/min,检测波长:254 nm,柱温:30℃。

表1 梯度洗脱程序 (%)

在选定的色谱条件下测定17种氨基酸衍生物峰与其它相邻峰分离度均大于1.5;按L-羟脯氨酸衍生物峰计算,理论板数在4 000以上。17种氨基酸对照品和供试品衍生物的高效液相色谱图见图1。

2.2 6种氨基酸对照品贮备液的制备

分别精密称取6种氨基酸对照品,加0.1 mol/L盐酸制成每1 mL分别含L-谷氨酸0.338 mg、L-羟脯氨酸 0.356 mg、 甘氨酸 0.762 mg、L-丙氨酸0.324 mg、L-精氨酸 0.236 mg、L-脯氨酸 0.506 mg的混合对照品贮备液。

2.3 17种氨基酸混合对照品溶液和供试品溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备 精密称取L-天冬氨酸等17种氨基酸对照品于量瓶中,用0.1 mol/L盐酸溶液配制成每1 mL分别含L-天冬氨酸43.2μg、L- 谷氨酸73.1μg、L- 羟脯氨酸86.4μg、L-丝氨酸 26.8μg、甘氨酸 160.9μg、L-组氨酸6.4μg、L-苏氨酸 15.6μg、L-丙氨酸64.8μg、L-精氨酸 59.3μg、L-脯氨酸 93.9μg、L-酪氨酸 7.2μg、L-缬氨酸 21.2μg、L-甲硫氨酸12.4μg、L- 异亮氨酸12.8μg、L- 亮 氨 酸28.0μg、L-苯丙氨酸 15.6μg、L-赖氨酸 31.2μg的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备[6]将阿胶样品研磨成粉后,取0.1 g于安瓿瓶中,精密称定,加6 mol/L盐酸5 mL,置酒精喷灯上拉丝封口,超声30 min使其溶解,150℃水解1 h,放冷,移入蒸发皿中,用10 mL水分次洗涤安瓿瓶,洗液并入蒸发皿,水浴蒸干。残渣加0.1 mol/L盐酸溶解,转移至100 mL量瓶中,加0.1 mol/L盐酸稀释至刻度,摇匀,即得。

2.3.3 异硫氰酸苯酯衍生化物的制备 取上述17种氨基酸混合对照品溶液和供试品溶液各2 mL,分别置10 mL离心管中,加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液1.0 mL,1 mol/L三乙胺乙腈溶液1.0 mL,漩涡混合1 min,放置1 h后,加入4 mL正已烷,漩涡混合1 min后,放置10 min,取下层溶液,滤过,即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取L-谷氨酸等6种混合氨基酸对照品贮备液 1、2、3、4、5、6 mL, 分别置于 10 mL 量瓶中,用0.1 mol/L盐酸加至刻度,摇匀。按“2.3.3”项下衍生化处理后,分别吸取上述溶液5 μL注入液相色谱仪中,测定峰面积积分值,以进样量(μg)为横坐标,相应峰面积积分值(mv)为纵坐标,绘制标准曲线,得6种氨基酸的回归方程、相关系数及线性范围,结果见表2。

表2 L-谷氨酸等6种氨基酸的线性关系考察

2.5 精密度试验

取阿胶(长沙1批)依“2.3”法制备供试品溶液,每次进样5 μL,重复进样6次,测定L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的峰面积积分值,结果RSD分别为1.7%、1.9%、1.9%、1.4%、1.8%及1.7%,表明本方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

取阿胶(长沙1批)依“2.3”法制备供试品溶液,分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样 5 μL, 测定 L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的峰面积,结果RSD分别为1.5%、1.8%、1.5%、0.9%、1.4%及1.7%,表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取阿胶(长沙1批)依“2.3”法制备供试品溶液共6份,测定样品中L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸含量,RSD分别为1.6%、1.5%、1.7%、1.8%、1.7%及1.6%,表明本方法重复性好。

2.8 加样回收试验

取阿胶(长沙1批)适量,研细,取约0.05 g,共6份,精密称定,分别精密加入适量的L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,经衍生化后测定各氨基酸的含量,计算回收率。得L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的回收率(RSD)分别为 97.7%(3.4%)、99.3%(3.3%)、100.1%(2.8%)、97.4%(2.7%)、97.5%(3.2%)及 99.3%(1.6%)。结果表明6种氨基酸回收率较好。

2.9 样品测定

按“2.3”项下方法制备各阿胶样品的供试品溶液,按“2.1”色谱条件下进样测定,用峰面积按外标法定量计算,结果见表3。

表3 10批阿胶样品17种氨基酸含量测定结果 (n=2,%)

3 讨论

流动相的选择中,参考了2010版《中国药典》一部阿胶质量标准中的流动相系统,但梯度的设计比《中国药典》标准更精密,使17种氨基酸得到很好的分离,药典标准中只测定了其中4种氨基酸的含量,本方法操作简便,结果基本可靠,能更全面反映阿胶中水解氨基酸的组成及含量,可作为阿胶质量控制的依据。

阿胶水解氨基酸的制备中,考察了130℃水解5 h和150℃水解1 h,结果发现两者所测得的氨基酸含量差别不大,说明都已经水解完全,所以选用150℃水解1 h。

本实验对10批阿胶的水解氨基酸组成及含量进行了分析,虽然文献报道阿胶含有18种氨基酸,但在实际检测中,未检测出胱氨酸,故共测定了其中的17种氨基酸含量且总含量大于80%(82.4%~96.8%)。由于对照品的原因,只做了中检所提供的6种氨基酸的线性关系考察和回收率试验,结果可靠,其他11种氨基酸的含量测定结果也具参考价值。

[1]宋立人,洪 恂,丁绪亮,等.现代中药学大辞典[M].北京:人民卫生出版社,2001∶1 118

[2]陈定一,王静竹,刘文林.阿胶及其炮制品中氨基酸和微量元素的分析研究[J].中国中药杂志,1991,16(2):833-835.

[3]宋志峰,王 丽,纪 锋,等.氨基酸分析中的柱前衍生技术[J].吉林农业科学,2004,29(6):54-58.

[4]胡建鸿,邱 利,王成润,等.柱前衍生反相高效液相色谱法同时测定保健饮品中16种氨基酸[J].食品科技,2008(10):211-214.

[5]杨 菁,孙黎光,白秀珍,等.异硫氰酸苯酯柱前衍生化高效液相色谱法同时测定 18 种氨基酸[J].色谱,2002,20(4):369-371.

[6]程显隆,肖新月,邹秦文,等.柱前衍生化HPLC法同时测定阿胶中4 种主要氨基酸的含量[J].药物分析杂志,2008(12):1 997-2 000.

(本文编辑 杨 瑛)

Determination of 17 kinds of hydrolyzed amino acids content in donkey-hide glue by HPLC with pre-column derivatization

XIE Yi,YI Yang,LIU Yang,PENG Yi-bo,WANG Shi-qiang
(Institute of Chinese Materia Medica,TCM Academy of Hunan,Changsha,Hunan 410013,China)

Objective To determine the contents of 17 kinds of hydrolyzed amino acids in donkey-hide glue by HPLC with pre-column derivatization at the same time.Methods To extract amino acids by the method of hydrolysis in 6 mol/L HCl and use phenylisothiocyanate(PITC)as the derivating agent.The Hypersil BDS C18column(200 mm×4.6 mm,5 μm)was used.Under the condition of gradient elution,the flow rate was 1.0 mL/min,the UV detection wavelength was 254 nm,and the column temperature was 30℃.Results 17 kinds of amino acids can be separated well in 60 min.The average recoveries were 97.4%~100.1%and RSD were 1.6%~3.4%.Conclusion The method is reliable for the determination of 17 kinds of amino acids in donkey-hide glue.

donkey-hide glue;17 kinds of amino acids;acid hydrolysis;HPLC with pre-column derivatization

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2012.05.011.046.04

2011-10-19

谢 谊(1974-),女,白族,湖南怀化人,助理研究员,硕士,主要从事中药制剂分析工作。

* 王实强,男,研究员,E-mail:wsq8135@163.com。

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