蛴螬提取物对大鼠光损伤视网膜变性NF-κB表达及核转位的影响

吴大力 ，谭涵宇 ，彭清华

（1.湖南中医药大学第一附属医院眼科学重点学科，湖南 长沙 410007；2.广西中医学院第一附属医院，广西 南宁 530023）

蛴螬提取物对大鼠光损伤视网膜变性NF-κB表达及核转位的影响

吴大力1，2，谭涵宇1*，彭清华1*

（1.湖南中医药大学第一附属医院眼科学重点学科，湖南 长沙 410007；2.广西中医学院第一附属医院，广西 南宁 530023）

目的 探讨蛴螬提取物对大鼠光损伤视网膜变性核因子κB（NF-κB）表达的影响。方法 将48只大鼠随机分成6组，分别为空白组、模型组、驻景丸组、蛴螬低、中、高剂量组，每组8只动物，16只眼。除空白组外，其余5组均建立光损伤视网膜变性模型，分组给药3周后取材做NF-κB免疫组化检测，计算机系统图像分析结果并进行统计分析。结果 与模型组比较，蛴螬中、高剂量组的NF-κB积分光密度和核转位数增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论蛴螬通过增加NF-κB信号通路的活化，抑制细胞凋亡死亡受体信号通路来发挥保护视网膜作用。

蛴螬提取物；光损伤；核因子κB；核转位；大鼠

老年性黄斑变性（AMD），是临床上老年人眼病中的常见病，是导致50岁以上老年人视力下降和致盲的主要原因之一。AMD病因很复杂，发病机制不明，近期国内外的许多文献报道其发病机制与长期光照的积累效应有关[1-2]。目前比较公认的是光损害及视网膜上皮细胞代谢功能衰退。由于视网膜光损伤的病理过程与AMD及视网膜色素变性有许多相似之处，因此，视网膜光损伤是研究视网膜变性类疾病良好的动物模型[3]。蛴螬是金龟子的幼虫，《中药大词典》记载蛴螬有破血、行瘀、散结、通乳、解毒、消疮、明目的功能[4]，本文通过建立视网膜光损伤大鼠模型，探讨蛴螬提取物的干预作用，以及对大鼠光损伤视网膜变性核因子κB（NF-κB）表达及核转位的影响。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用8周龄SD大鼠48只，雄性，体质量150～170 g。动物由湖南中医药大学动物实验中心代购[许可证号 SCXK（湘）2008-0015]。

1.1.2 蛴螬提取物的制备 蛴螬1000 g，清洗10遍以上，浸泡12 h后，洗至无臭味。加蒸馏水5 kg，加37%HCl调pH 2。高压蒸气锅蒸2 h(压力0.15 MPa，压力达 0.05 MPa 时放气并计时)。 纱布（4～5层）过滤，溶液中加40%NaOH调pH 6.5～6.8。冷却，隔水加热，浓缩至1 000 mL（生药1 g/mL）。装瓶，压盖，蒸气高温灭菌，冷藏保存。

1.1.3 驻景丸加减方《中医眼科六经法要》混悬液的制备 药物组成：楮实子10 g，菟丝子10 g，茺蔚子10 g，枸杞子 10 g，车前子 5 g，木瓜 10 g，寒水石10 g，河车粉 5 g，生三七 2 g，五味子 5 g。共 4 剂，均一次性购于长沙市芝灵大药房。制备：用药物总体积4倍量水浸泡 30 min，加热煎煮 40 min，纱布（4～5层）滤取煎液，再用原药物总体积2倍量水煎煮40 min，合并2次煎液，约300 mL，并加蒸馏水调整为1 g/mL，4℃储存，备用。

1.1.4 试剂 戊巴比妥钠：上海化学试剂厂分装，临用时配制成3%戊巴比妥钠溶液；一抗：NF-κB p65 rabbit polycloned IgG（产品代码：bao0610）；购自武汉博士德公司；相应二抗及试剂盒：购自北京杉金桥生物技术有限公司。

1.1.5 仪器 电子秤：上海天平仪器厂生产，型号：JY0001；眼科显微手术器械:苏州医疗器械厂生产；勒克斯照度计：上海嘉定学联仪器厂生产，型号：ZDS-10；眼科手术显微镜：苏州医疗器械设备厂生产，型号：YZZOT；HHS-2型电子恒温不锈钢水浴锅:上海南阳仪器有限公司生产；LEICA DM LB2型双目显微镜：德国LEICA公司生产；S2-93型自动双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂生产；MoticB5显微摄像系统：麦克奥迪实业集团公司生产；Image Pro Plus 6.0计算机图像分析系统，美国2006年研发。以上相关器材及相关物品均由湖南中医药大学生理实验室和眼科科研实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 动物购回驯养1周后，随机分为：空白组(A)、模型组(B)、驻景丸组(C)、蛴螬低剂量组（D），蛴螬中剂量组（E），蛴螬高剂量组（F），每组 8只动物，16只眼。

1.2.2 造模方法 采用自制光化学损伤装置：在光照架的6个面分别放置1根40W的白色荧光灯管。调节光照强度，并用ZDS-10型数字式照度计测定大鼠活动水平多点照度，平均为（2 000±200）1x。 动物房的室温控制在21～24℃，光照箱内的平均温度为22～25℃。所有实验动物在12 h明(30-50 1x)及12 h暗环境下循环光环境适应7 d，自由摄食饮水。7 d后光照前先暗适应24 h，然后光照12 h(晚上8:00至次日早上8:00)，再进行暗适应12 h，连续3个循环，光照时间总计为36 h。大鼠不散瞳及麻醉，可在光照箱内自由活动，光照后送回暗环境中饲养。A组不施行光照试验。

1.2.3 给药剂量及方法 A组：给等容积蒸馏水灌胃；B组：分别给等容积蒸馏水灌胃；C组：成人日用量5倍剂量；D组：成人日用量5倍剂量；E组：10倍剂量；F组：20倍剂量。A组及B组每日以生理盐水2 mL灌胃。给药剂量按成人70 kg体表面积换算，用药剂量 0.56 g／kg，相对应的 C、D、E、F 组给药剂量分别为 2.8、2.8、5.6、11.2 g/kg。 每日灌胃 1 次，连续给药2周后，光照造模7 d后继续给药1周。用2%戊巴比妥钠0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，12点钟位缝线标记，立即摘除眼球(包括球后视神经2 mm)，角膜穿通一小切口，浸泡于15%甲醛组织固定液中。24 h后沿标记缝线至视神经连线对剖眼球，去除眼前节和玻璃体，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋，经视乳头颞侧旁开1 mm纵向做4 μm厚的切片，烘干备用。

1.2.4 NF-κB免疫组化检测 SP法：采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶染色及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。主要染色过程如下：石蜡切片脱蜡至水，用PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)冲洗 5 min×3 次。 3%H2O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。10%的正常山羊血清 (PBS稀释)封闭，室温孵育10 min。倾去血清，勿洗，滴加1∶100比例稀释的一抗，37 ℃孵育 1 h。PBS冲洗，5 min×3次。滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，置37℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，苏木精复染，封片。在10×10低倍视野下进行全面观察，寻找视网膜内NF-κB阳性物质和核转位细胞数最丰富区域(即“热点”区，染色颜色最深/或染色面积最多)，然后在10×40倍视野下选择5个热点区，采用图形分析系统定量测量指标阳性积分光密度和计数细胞核阳性的细胞数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行分析。多组比较用单因素方差分析，组间两两比较用q检验(SNK法)，相关性分析用Bivariate分析。各项指标均以 “”表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蛴螬对大鼠视网膜NF-κB表达的影响

A组视网膜外核层细胞中NF-κB阳性物质弥漫分布，含量较多，呈棕黄色细颗粒状。B组视网膜外核层细胞中NF-κB阳性物质分布稀疏，含量较少，呈淡黄色细颗粒状。蛴螬各组和C组视网膜外核层细胞浆中NF-κB阳性物质有不同程度增加，积分光密度结果见表1，图1。

2.2 蛴螬对大鼠视网膜NF-κB核转位的影响

A组视网膜外核层细胞浆中未见NF-κB核转位阳性物质分布，B组视网膜外核层细胞浆中NF-κB核转位阳性物质含量少，蛴螬各剂量组和C组视网膜外核层细胞浆中NF-κB核转位阳性物质有不同程度增多，弥漫分布，呈棕黄色细颗粒状，结果见表2。

表1 各组间大鼠视网膜NF-κB表达的比较 （）

表1 各组间大鼠视网膜NF-κB表达的比较 （）

注：与A组比较*P＜0.05；与B组比较▲P＜0.05；与D组比较★P＜0.05。

组 别A组B组C组D组E组F组眼数（只） 药物剂量(g/kg)888888— —2.8 2.8 5.6 11.2积分光密度（×105）7.46±1.27 4.59±1.06*5.96±1.14*▲★5.15±1.30*5.87±0.98*▲★5.91±1.01*▲★

图1 蛴螬提取物对大鼠视网膜NF-κB表达影响的光镜图（×400）

表2 各组间大鼠视网膜NF-κB核转位的比较 （）

表2 各组间大鼠视网膜NF-κB核转位的比较 （）

注：与B组比较*P<0.05。

组别A组B组C组D组E组F组眼数（只）药物剂量(g/kg)888888— —2.8 2.8 5.6 11.2核转位总数(个)0 47 68 58 69 68核转位均数(个)0 5.88±2.47 8.50±2.77*6.63±2.50 8.75±2.49*8.63±2.49*

3 讨论

中医没有AMD的病名记载，根据其临床症状，属于“视瞻昏渺”、“视正反斜”等范畴。AMD是一种由多因素引起的疾病，其真正的病因还不清楚，可能与年龄、家族史、种族、抽烟、营养不良、中毒、药物作用、免疫异常、光的慢性损伤等因素有关，也可能是以上多因素综合作用结果。但慢性光损害及视网膜上皮细胞代谢功能衰退是比较公认的。

蛴螬古文献收录为药用，始载于《神农本草经》：“主恶血血瘀痹气，破折血在胁下坚满痛，月闭，目中淫肤，青翳白膜。”近年来研究表明蛴螬富含微量元素、氨基酸及维生素，有提高机体免疫力、抑制增殖、抗氧化、抗衰老、保护视网膜视神经细胞等作用[5-9]。Sen等首次从鼠B淋巴细胞核提取物中，发现一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列(GGGACTTTCC)特异结合，调节其基因表达的核蛋白因子，称之为核因子κB。现已清楚，在视网膜光化学损伤中，NF-κB体系能阻断凋亡信号的传递，保护感光细胞，是抗凋亡的关键调控因子。另外，用突变型I-κB与NF-κB结合以后抑制其核转移，可抑制光损伤所致的细胞凋亡，说明NF-κB在此病理过程中对光感受器细胞起重要的保护作用。

在本研究中，发现B组NF-κB积分光密度及NF-κB核转位数少，E、F剂量组NF-κB积分光密度及NF-κB核转位数增加。表明视网膜光损伤后NF-κB 含量减低，NF-κB 核转位数减少，E、F 剂量组NF-κB含量增加，NF-κB核转位数增加，提示蛴螬可能通过活化NF-κB信号通路，有效地减轻光损伤诱发的光感受器细胞的凋亡，从而发挥防护作用。

[1]Young RW.Solar radiation and age-related macular degeneration[J].Surv Oph-thalmol，1988，32(4):252-269.

[2]Kerr JFR，Wyllie AH，Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with ranging in plications in tissue kinetics[J].Br J Cancer，1972（26）:239.

[3]Organisciak DT， Darrow RM， Barsalou L， et a1.Light history and age-related changes in retinal light damage[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1998（39）:1 107-1 116.

[4]江苏新医学院.中药大辞典（下册）[M].上海：上海人民出版社，1977：2 379.

[5]阳长明，侯世祥，王新春，等.蛴螬与蛴螬滴眼液的成分研究[J].中药材，2000，23(12)：769-771.

[6]张庆镐，朴奎善，李基俊，等.蛴螬矿物元素和维生素含量分析[J].微量元素与健康研究，2002，19(1)：30-31.

[7]宋莲莲，孙 抒，刘树森，等.蛴螬粗提物对人宫颈癌Hela细胞抑制作用的形态学观察[J].时珍国医国药，2006，17(5)：673-675.

[8]陈 梅，邱晓星，彭清华，等.蛴螬提取物对兔脉络膜新生血管VEGF和bFGF表达的影响 [J].国际眼科杂志，2008，8（12）：2 443-2 448.

[9]张波涛，彭清华，叶群如，等.蛴螬对兔视网膜静脉阻塞模型iNOS表达的干预研究[J].湖南中医药大学学报，2008，28(1):25-28.

（本文编辑 彭芝配）

Effects of grub extracts on the expression of NF-κB and its nuclear translocation in rats'retinal degeneration by light damage

WU Da-li1,2， TAN Han-yu1， PENG Qing-hua1
(1.Key discipline of Ophthalmology， First Affiliated Hosipital， TCM Universtiy of Hunan，Changsha，Hunan 410007， China;2.TCM College of Guangxi， Nanning， Guangxi 530001， China)

Objective To discuss the effects of grub extracts on the expressions of NF-κB and its nuclear translocation in rats'retinal degeneration by light damage.Methods 48 rabbits were randomly divided into 6 groups as follows：blank group,model group,Zhujing pill group and grub extracts low,middle,high dosage group，8 rabbits with 16 eyes in each group.Except for the blank group,the others were made retinal degeneration model by light damage.After treated for 3 weeks,all rabbits were taken specimen to check NF-κB expression levels by immnohistochemistry.Results were analyzed by computer image system.Results Compared with the model group，optical density of NF -κB and the numbers of nuclear translocation in middlle and high dosage grub group were increased significantly(P＜0.05).Conclusion Grub can inhibit apotosis receptor signal pathway to protect retina by activating NF-κB signal pathway.

grub extracts； light damage； nuclear factor-kappa B； nuclear translocation； rat

*谭涵宇，在读博士研究生，讲师，E-mail：thy612@126.com；彭清华，医学博士，教授、主任医师、博士研究生导师，E-mail：pqh410007@126.com。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.05.008.035.04

2011－12－29

湖南省教育厅科研基金资助项目（09C729）；湖南省卫生厅中医药科研基金资助项目（2010012）；国家中医药管理局中医眼科学重点学科建设项目；湖南省中医五官科学重点学科建设项目。

吴大力（1967-），男，湖南株州人，医学博士，主要从事中医药治疗眼底疾病的研究。