人工栽培大叶千斤拔总黄酮含量的动态变化研究

刘佳胜，周日宝*，李凤娟，王朝晖，刘湘丹，孙梦姗

（湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

人工栽培大叶千斤拔总黄酮含量的动态变化研究

刘佳胜，周日宝*，李凤娟，王朝晖，刘湘丹，孙梦姗

（湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

目的 探讨人工栽培大叶千斤拔药材的最佳采收期。方法 采用紫外-分光光度法测定不同采收期根和茎中总黄酮含量的动态变化，样品用95%乙醇超声提取3次，每次50 min，以芦丁为对照品，测定波长为510 nm。结果人工栽培大叶千斤拔根中总黄酮含量高于茎中的含量，根中的含量较高，且含量比较稳定，茎中含量随着生育期延长逐步增加。结论 大叶千斤拔以植株落叶进入休眠期为药材最佳采收期。

大叶千斤拔；人工栽培；总黄酮；采收期；药用部位；紫外-分光光度法

《中国药典》2010年版一部收录了中成药妇科千金片，该药具有清热除湿，益气化瘀的功效，是妇科保健和治疗的常用中成药[1]。千斤拔药材是中成药妇科千金片的主要原料，其传统用药部位为其根部[2]，千斤拔中的主要有效成分为黄酮类化合物[3]，具有止血、化瘀功效。长期以来，中成药妇科千金片生产中一直收购野生千斤拔原料，导致野生千斤拔资源濒临枯竭，千斤拔药材已远远不能满足妇科千金片生产的需求。湖南省炎陵已开展了大叶千斤拔的人工种植，人工种植刚刚起步，本文探讨了人工栽培大叶千斤拔的根和茎中总黄酮含量动态变化规律，以期为人工栽培大叶千斤拔药材最佳采收期的确定提供实验依据。

1 实验材料

1.1 材料

实验样品采自湖南省炎陵县大叶千斤拔人工种植研究试验基地，经湖南中医药大学潘清平教授鉴定药材原植物系豆科千斤拔属大叶千斤拔（Flemingia macrophylla(willd.)prain）。 从 2009年10月5日起至2010年1月5日止每隔10 d采集植株，晒干，分别取植株的根、茎作实验供试品。

1.2 试剂

乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠（均为分析纯），芦丁对照品（中国药品生物制品鉴定所提供，批号：1001080-200707）。

1.3 仪器

752pc型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA2004电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；旋转蒸发器RE-52A(巩义市予华仪器有限公司）；FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取过40目筛的药材粉末3 g精密称定，加95%乙醇 100 mL，70℃超声提取三次，每次50 min，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至滤液低于50 mL时，置50 mL量瓶中，加乙醇定容，备用。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取于120℃干燥至恒重的芦丁对照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，加入乙醇10 mL，置温水中加热使溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(含无水芦丁 200μg／mL)。

2.3 吸收波长的确定

取对照品溶液和供试品溶液各5 mL，分别置25 mL量瓶中，定容，摇匀后分别于400～700 nm波长范围扫描，两种溶液在510 nm处均无吸收峰。另取对照品和供试品溶液各5 mL，分别置25 mL量瓶中，加 5%亚硝酸钠 1 mL，摇匀，放置 6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置 6 min，加4%氢氧化钠4 mL，再加乙醇至刻度，摇匀，放置15 min后分别于400～700 nm波长范围扫描，在510 nm处均有最大吸收。

2.4 线性关系考察

精密量取对照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分别置10 mL量瓶中，各加乙醇至10 mL，显色方法同“2.3”，以相应的溶液为空白对照。测定吸光度，绘制浓度-吸光度标准曲线，求得回归方程

A=11.986 9C-0.035 7(r=0.996 8)

结果表明芦丁在0.100～0.700 mg/mL范围内溶液浓度与吸光度的线性关系良好。

2.5 精密度实验

取同一供试品溶液，连续6次进样，测定吸光度，其吸光度的平均值为x=0.659，RSD=1.44%，表明该方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，于 0、1、3、6、9、12 h 进行测定吸光度，其吸光度的平均值为x=0.657，RSD=2.08%，表明该溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批次药材6份，按“2.1”方法制备供试品溶液，测得其总黄酮含量的平均值x=0.551%，RSD=1.41%，表明该方法具有良好的重复性。

2.8 回收率实验

精密称取2009年10月05日的大叶千斤拔茎的药材粉末1.50 g(总黄酮含量为0.553%)，精密加入芦丁对照品，按“2.1”方法平行制备6份，精密量取供试品溶液3 mL，分别置50 mL量瓶中，加5%亚硝酸钠1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠4 mL，再加乙醇至刻度，摇匀，放置15 min后测定。结果芦丁的平均回收率为99.60%，RSD=2.12%。结果见表1。

表1 加样回收率实验结果 （n=6）

2.9 样品含量测定

每次取3份相同采收期的大叶千斤拔药材粉末各3 g，按照“2.1”项的方法处理后，精密量取供试品溶液3 mL，分别置50 mL量瓶中，加5%亚硝酸钠1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠4 mL，再加乙醇至刻度，摇匀，放置15 min后测定吸光度。用回归方程计算总黄酮含量，测得同一采收期大叶千斤拔药材的3个样品的值，并计算其RSD值，结果见表2。

表2 大叶千斤拔不同采收期各部位总黄酮含量测定结果 （%，n=3）

3 讨论

本实验对样品的提取考察了回流法、超声法以及索氏提取法，结果发现，超声法提取总黄酮的含量高于索氏法，与回流法相当，考虑到回流法提取时间长，消耗能量较多，因此选择超声提取法。

同一采收期，大叶千斤拔根中总黄酮含量高于茎中的。随着植株生长期的延长，其茎中的总黄酮含量不断增加，大叶千斤拔根中有效成分总黄酮含量最高，而根部的总黄酮含量变化不明显，见图1。

图1 不同采收期大叶千斤拔根和茎中总黄酮含量的折线图

大叶千斤拔中含有黄酮类、萜、甾类、鞣质类、糖类、生物碱类和氨基酸类[4]等物质，总黄酮是其主要的有效成分，可将其含量的高低作为衡量大叶千斤拔药用价值的一个重要参考指标。传统上，民间习惯将大叶千斤拔的根入药[2]，在大叶千斤拔整个生育期后期，根中有效成分总黄酮含量一直较高，在1.60%至1.83%之间，且含量比较稳定，所以在植株生育后期采收药材其药用价值是比较高的，本文也从一个方面佐证了传统上民间习惯用药的科学性，即大叶千斤拔以植株落叶进入休眠期采收较为合适。研究结果为大叶千斤拔野生变家种和人工规范化种植时适时采收提供了实验依据。

大叶千斤拔整个植株落叶进入休眠期后，茎中有效成分总黄酮含量增高，达1.3%以上，其含量略低于根中的，同时二年生植株及其二年生以上的大叶千斤拔植株的茎的生物产量远大于根的，本文的研究结果也为大叶千斤拔的综合开发和利用提供了实验依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：727.

[2]湖南省卫生厅.湖南省中药材标准[S].长沙：湖南科学技术出版社，1993：34.

[3]刘建华，高丽欣，高玉琼，等.千斤拔挥发性成分的研究[J].中成药，2003，25(6)：485-487.

[4]任朝琴，刘 圆.不同种不同药用部位不同产地千斤拔中总黄酮的含量测定[J].时珍国医国药，2010，21(10)：2 492-2 494.

（本文编辑 杨 瑛）

Research on changes of total flavonoids content in cultivated Flemingia macrophylla(willd.)Prain

LIU Jia-sheng，ZHOU Ri-bao*，LI Feng-juan， WANG Zhao-hui，Liu Xiang-dan，SUN Meng-shan
（Pharmaceutical College,TCM University of Hunan，Changsha，Hunan 410208）

Objective To determine the optimum harvest time of the cultivated Flemingia macrophylla(Willd.)Prain.Method Using 95%ethanol ultrasound extraction for three times,once 50 minutes, rutin as reference substance, measured wavelength is 510 nm,the dynamic changes of total flavonoids in trunk and root with different harvest time is tested by UV spectrophotometry.Result Total flavonolds contents of cultivated Flemingia macrophylla(Willd.)Prain in root is more than trunk,total flavonoids content is always high and steady in root,and the content of total flavonoids in trunk is gradually increased as the extent of growth season.Conclusion The optimum harvest time of the Flemingia macrophylla(Willd.)Prain is in which the plant defoliation and enters dormancy stage.

Flemingia macrophylla(willd.)prain；Cultivated； Total flavonoids； Harvest times；Medical material part;ultraviolet spectrophotometer

R282.4

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.05.010.043.03

2012－03－07

湖南省教育厅高校创新平台开放基金（09k061）；湖南省中医药管理局资助项目（2009010）。

刘佳胜（1983-），湖南邵阳人，2009级硕士研究生，从事中药资源与质量研究。

* 周日宝，男，教授，博导，E-mail：zhouribao20032003@yahoo.com.cn。