EBV-DNA定量检测对鼻咽癌的诊断价值

朱 旭 梁永彪 郑利平

南宁市第二人民医院检验科，广西南宁 530031

我国是鼻咽癌的高发国家，其发病率占头颈部肿瘤的首位。已有大量的实验研究表明，EB病毒（Ep.Stein-Barr virus，EBV）与鼻咽癌关联密切，传统的EB病毒相关抗体的检测是诊断及监测患者病情最常用的方法，但是它的敏感性和特异性较差[1]。本研究应用荧光定量PCR技术对鼻咽癌患者血浆EBV-DNA进行检测，旨在探讨EBV-DNA在鼻咽癌诊断方面的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2006年1月～2010年10月在笔者所在医院住院的初诊鼻咽癌患者50例为研究组，其中男33例，女17例；年龄23～72岁，平均（45.0±4.2）岁；病理类型：中分化鳞癌6例，低分化鳞癌44例。所有患者均未进行任何治疗。选择同期住院的头颈部其他癌瘤患者20例作为病例对照组，其中男12例，女8例；年龄26～70岁，平均（46.2±3.9）岁；所有患者均有病理及细胞学诊断依据。以同期健康体检者50例作为健康对照组，男26例，女24例；平均（41.0±4.4）岁。

1.2 研究方法

1.2.1 标本收集 所有对象均抽取3 mL的外周血，加入到EDTA抗凝试管中，离心后分离出2 mL血浆，保持-20℃冻存。

1.2.2 DNA抽提 上述20 mL血浆抽提DNA，EBV基因扩增试剂盒由中山大学达安基因诊断中心提供，仪器为Roche LightCycler型PCR仪（美国），检测方法按说明书进行。

1.2.3 血浆EBV-DNA检测采用荧光定量PCR法 上游引物：5’-CCCAA-CACTCCACCA-CACG-3’，下游引物：5’-TCT-TAGGAGCTGTCCGAGGG-3’，探针序列：5’-CTGTCTGTAAAGTCCAGC-CTCC-（TAMRA）-3’。扩增程序：93℃ 2 min，1个循环→ 93℃ 5 s，57℃ 45 s，40个循环→ 37℃，1 min，1个循环。518 nm为检测波长，阳性定量参考品为 1×107、1×106、1×105、1×104拷贝 /mL的EBV-DNA 的BamHI-W片段阳性模板，小于最低检出限（1×103拷贝/mL）为阴性。

1.2.4 EBV-DNA含量计算公式

C：为血浆中待测DNA的拷贝数（拷贝/mL）；Q：为1次PCR反应后检测到的 DNA拷贝数；VDNA：为抽提得到的DNA液总体积；VPCR：为用于PCR反应的DNA液体积；VEXT：为用于抽提DNT的血浆总量。

比较鼻咽癌患者与各对照组血浆EB病毒DNA拷贝数，分析血浆游离DNA含量与鼻咽癌分期的关系，统计EBV-DNA阳性检出率。

1.3 统计学处理

应用SPSS13.0统计软件，采用x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

3组血浆EBV-DNA阳性检出率显示，鼻咽癌组患者血浆EBV-DNA阳性检出率明显高于病例对照组及健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），病例对照组及健康对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组血浆EBV-DNA检出率[n（%）]

3 讨论

鼻咽癌原发病灶比较隐蔽，临床很难做出早期诊断，容易造成漏、误诊。因此，笔者旨在找出一种有效的可以做到早期检测的方法。事实上已经有大量的研究资料显示，EBV与鼻咽癌之间存在着密切的联系[2]，鼻咽癌患者血浆EBV-DNA水平与肿瘤复发关系密切。EBV属于疱疹病毒，是一种DNA病毒，是自然界中普遍感染人类的病毒。鼻咽癌患者EBV-DNA检测标本，多采用肿瘤组织、转移的淋巴结以及外周血中血浆等。肿瘤组织和淋巴结标本虽然准确率最高，但取得比较复杂，操作不便，对患者痛苦较大，不能适用于鼻咽癌的筛查以及对病情的监测。血浆标本获取较方便，国外有研究显示应用全血标本比血浆可更大地提高检测的敏感度。本研究采用荧光定量PCR技术定量检测鼻咽癌患者外周血血浆中的EBV-DNA，结果显示鼻咽癌组患者血浆EBV-DNA阳性检出率为72%，显著高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究结果表明，血浆EBV-DNA水平可以作为监测鼻咽癌疗效的肿瘤标记物。应用荧光定量PCR检测血浆EBV-DNA是诊断鼻咽癌的有效方法，操作简单，准确率较高，尤其适用于发病高危地区和高危人群的筛查。

[1] 李杰.血浆EBV-DNA检测对鼻咽癌的诊断价值的探讨[J].医学检验与临床，2011，22（1）：20-21.

[2] 廖勇，罗志强.血浆EB病毒DNA定量测定对鼻咽癌的诊断价值[J].中外耳鼻咽喉颅底外科杂志，2007，13（3）：186-187.