朱 旭 梁永彪 郑利平
南宁市第二人民医院检验科,广西南宁 530031
我国是鼻咽癌的高发国家,其发病率占头颈部肿瘤的首位。已有大量的实验研究表明,EB病毒(Ep.Stein-Barr virus,EBV)与鼻咽癌关联密切,传统的EB病毒相关抗体的检测是诊断及监测患者病情最常用的方法,但是它的敏感性和特异性较差[1]。本研究应用荧光定量PCR技术对鼻咽癌患者血浆EBV-DNA进行检测,旨在探讨EBV-DNA在鼻咽癌诊断方面的价值,现报道如下。
收集2006年1月~2010年10月在笔者所在医院住院的初诊鼻咽癌患者50例为研究组,其中男33例,女17例;年龄23~72岁,平均(45.0±4.2)岁;病理类型:中分化鳞癌6例,低分化鳞癌44例。所有患者均未进行任何治疗。选择同期住院的头颈部其他癌瘤患者20例作为病例对照组,其中男12例,女8例;年龄26~70岁,平均(46.2±3.9)岁;所有患者均有病理及细胞学诊断依据。以同期健康体检者50例作为健康对照组,男26例,女24例;平均(41.0±4.4)岁。
1.2.1 标本收集 所有对象均抽取3 mL的外周血,加入到EDTA抗凝试管中,离心后分离出2 mL血浆,保持-20℃冻存。
1.2.2 DNA抽提 上述20 mL血浆抽提DNA,EBV基因扩增试剂盒由中山大学达安基因诊断中心提供,仪器为Roche LightCycler型PCR仪(美国),检测方法按说明书进行。
1.2.3 血浆EBV-DNA检测采用荧光定量PCR法 上游引物:5’-CCCAA-CACTCCACCA-CACG-3’,下游引物:5’-TCT-TAGGAGCTGTCCGAGGG-3’,探针序列:5’-CTGTCTGTAAAGTCCAGC-CTCC-(TAMRA)-3’。扩增程序:93℃ 2 min,1个循环→ 93℃ 5 s,57℃ 45 s,40个循环→ 37℃,1 min,1个循环。518 nm为检测波长,阳性定量参考品为 1×107、1×106、1×105、1×104拷贝 /mL的EBV-DNA 的BamHI-W片段阳性模板,小于最低检出限(1×103拷贝/mL)为阴性。
1.2.4 EBV-DNA含量计算公式
C:为血浆中待测DNA的拷贝数(拷贝/mL);Q:为1次PCR反应后检测到的 DNA拷贝数;VDNA:为抽提得到的DNA液总体积;VPCR:为用于PCR反应的DNA液体积;VEXT:为用于抽提DNT的血浆总量。
比较鼻咽癌患者与各对照组血浆EB病毒DNA拷贝数,分析血浆游离DNA含量与鼻咽癌分期的关系,统计EBV-DNA阳性检出率。
应用SPSS13.0统计软件,采用x2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
3组血浆EBV-DNA阳性检出率显示,鼻咽癌组患者血浆EBV-DNA阳性检出率明显高于病例对照组及健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05),病例对照组及健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 各组血浆EBV-DNA检出率[n(%)]
鼻咽癌原发病灶比较隐蔽,临床很难做出早期诊断,容易造成漏、误诊。因此,笔者旨在找出一种有效的可以做到早期检测的方法。事实上已经有大量的研究资料显示,EBV与鼻咽癌之间存在着密切的联系[2],鼻咽癌患者血浆EBV-DNA水平与肿瘤复发关系密切。EBV属于疱疹病毒,是一种DNA病毒,是自然界中普遍感染人类的病毒。鼻咽癌患者EBV-DNA检测标本,多采用肿瘤组织、转移的淋巴结以及外周血中血浆等。肿瘤组织和淋巴结标本虽然准确率最高,但取得比较复杂,操作不便,对患者痛苦较大,不能适用于鼻咽癌的筛查以及对病情的监测。血浆标本获取较方便,国外有研究显示应用全血标本比血浆可更大地提高检测的敏感度。本研究采用荧光定量PCR技术定量检测鼻咽癌患者外周血血浆中的EBV-DNA,结果显示鼻咽癌组患者血浆EBV-DNA阳性检出率为72%,显著高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05)。本研究结果表明,血浆EBV-DNA水平可以作为监测鼻咽癌疗效的肿瘤标记物。应用荧光定量PCR检测血浆EBV-DNA是诊断鼻咽癌的有效方法,操作简单,准确率较高,尤其适用于发病高危地区和高危人群的筛查。
[1] 李杰.血浆EBV-DNA检测对鼻咽癌的诊断价值的探讨[J].医学检验与临床,2011,22(1):20-21.
[2] 廖勇,罗志强.血浆EB病毒DNA定量测定对鼻咽癌的诊断价值[J].中外耳鼻咽喉颅底外科杂志,2007,13(3):186-187.