复方鱼腥草合剂的HPLC指纹图谱研究*

李转花，胡思玉，余启波，张德奎

四川科伦药物研究有限公司，成都 610500

复方鱼腥草合剂由鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘、金银花5味药经加工制成的复方制剂[1]。具有清热解毒之功效，用于外感风热引起的咽喉疼痛，急性咽炎、扁桃腺炎等。为了控制复方鱼腥草合剂的质量，有必要研究复方鱼腥草合剂的质量检测方法。近年来有不少文献报道采用高效液相色谱法测定复方鱼腥草合剂中的黄芩苷、绿原酸的含量，但未见相关的指纹图谱研究报道。本文探索了以HPLC指纹图谱技术为手段的质量控制方法[2]，以期更有效控制该产品的一致性、重现性。

1 仪器与试药

色谱仪：Waters2695-2996高效液相色谱仪（包括四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、PDA检测器、Empower色谱工作站）。

黄芩苷 （110715-200815）、绿原酸 （110753-200413）、槲皮苷（111538-200302）购自中国药品生物制品检定所；复方鱼腥草合剂由浙江国境药业有限公司提供；甲醇为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂为分析纯；水为超纯水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3（150mm×4.6mm，5μm）；以0.1%磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B；检测波长为320 nm；柱温：35℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；分析时间：66 min。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于4500。按表1条件进行梯度洗脱。

表1 流动相梯度洗脱条件

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取黄芩苷对照品、绿原酸对照品、槲皮苷对照品适量，分别加甲醇制成混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取复方鱼腥草合剂适量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 药材溶液 取复方鱼腥草合剂处方中的各药材，按照处方比例和提取工艺制备成鱼腥草供试品溶液、金银花供试品溶液、黄芩供试品溶液、连翘供试品溶液、板蓝根供试品溶液，分别取适量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为药材溶液供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 指纹图谱的方法学验证条件的优化 由于中药复方的成分复杂，优化的目的是尽量将不同极性的成分简化在一张色谱图中得到较好的分离.试验了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸不同梯度下的色谱图，比较了Inertsil ODS-3 150 mm×4.6 mm，5 μm和Alltech C18150 mm×4.6 mm，5 μm及Waters C18150 mm×4.6 mm，5 μm等不同牌号的色谱柱的分离效果，并对检测波长和柱温等参数进行了优化，最终确定了“2.1”所述色谱条件。

2.3.2 稳定性试验 取复方鱼腥草合剂，按“2.2.2”供试品溶液的制备方法处理，于0、2、4、6、8、12、24 h进样进行分析，直观观察各指纹图谱的全貌无明显差异，用相似度软件计算，在同台仪器测定色谱指纹图谱的相似度均大于0.98。计算各共有色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均低于2%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.3.3 精密度试验 精密量取复方鱼腥草合剂，按“2.2.2”供试品溶液的制备方法处理，连续进样5次检测，直观观察各指纹图谱的全貌无明显差异，用相似度软件计算，在同台仪器测定色谱指纹图谱的相似度均大于0.98。计算各共有色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均低于2%，表明精密度良好。

2.3.4 重复性试验 精密量取复方鱼腥草合剂，按“2.2.2”供试品溶液的制备方法处理，取供试品溶液6份，分别进样测定，观察各指纹图谱无明显差异，用相似度软件计算，在同台仪器测定色谱指纹图谱的相似度均大于0.98。计算各共有色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均低于2%，表明重复性良好。

2.3.5 指纹图谱建立 精密吸取对照品溶液、药材溶液、供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按选定的色谱条件，进行检测。同一实验条件下，测定12批供试品HPLC色谱图。根据不同批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（相对保留时间）等相关参数进行分析、比较，制定优化的指纹图谱，见图1～4。

2.4 指纹图谱分析

2.4.1 共有指纹峰的标定 分别取各批次复方鱼腥草合剂，按“2.2.2”项方法处理获得供试品溶液，进样10 μL，记录HPLC色谱图，结果见图4。主要有9个峰：2号峰为绿原酸；7号峰为黄芩苷；1号峰、6号峰来自于金银花；3、8号峰来自于黄芩；4号峰来自于连翘；5号峰为黄芩和连翘共有；9号峰来自于鱼腥草。因黄芩苷的吸收最强，故以黄芩苷作为参照峰。

经与参照品对照及比较所有测定和记录的色谱图，各批次复方鱼腥草合剂标定9个共有峰作为指纹图谱的特征峰（见表2及色谱图3～4），其中黄芩苷峰为参照峰。

图1 对照品图谱

图2 药材图谱

图3 对照指纹图谱

图4 12批样品指纹图谱

2.4.2 各批次复方鱼腥草合剂指纹图谱相似度评价 将各批次样品测定数据导入中国药典委员会推荐使用的 “中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004A”，经选峰，设定匹配模板，将峰自动匹配，然后设定标准模板，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出复方鱼腥草合剂HPLC对照指纹图谱，与对照指纹图谱比较，相似度结果见表3。

3 讨 论

3.1 检测波长的选择，DAD图谱可见，本品在200 nm～400 nm之间，9个共有峰均有吸收，最终选择共有峰吸收最强的320 nm作为测定波长。

3.2 本品中鱼腥草虽为君药，其抗菌活性成分癸酰乙醛含量测定已有文献报道[3]，但采用的是分光光度法，利用HPLC法测定鲜见报道。黄芩苷是复方鱼腥草合剂的主要药理活性成分，黄芩中有效成分黄芩苷具有良好的抗炎、抗菌、抗变态反应，且在本色谱系统中吸收最强。故采用黄芩苷作为参照品。

表2 各批次复方鱼腥草合剂指纹图谱共有峰相对保留时间

表3 复方鱼腥草合剂指纹图谱相似度数据

3.3 在本法条件下复方鱼腥草合剂中9个共有峰分离良好，相似度分析结果表明，各批次复方鱼腥草合剂之间具有较好的相似性，相似度均大于0.98。本文建立的复方鱼腥草合剂指纹图谱具有重复性好、特征性强、方法简便等特点，为复方鱼腥草合剂的质量控制奠定了基础。

3.4 复方鱼腥草合剂处方中的鱼腥草、金银花、连翘中均含有挥发性成分，本文主要考察了非挥发性成分的指纹图谱检测方法，还需对挥发性成分进行气相色谱研究，建立检测挥发性成分的指纹图谱，为更全面地控制复方鱼腥草合剂的质量提供依据。3.5 表3相似度计算结果均大于0.98，说明复方鱼腥草合剂的工艺稳定，不同批次产品的一致性较好。

[1] 国家食品药品监督管理局药品标准[S].WS-10821（ZD-0821）-2002-2011Z.

[2] 李晓蒙，徐位良，何新荣.鱼腥草药材中黄酮苷类成分的HPLC指纹图谱研究[J].广东药学院学报，2005，21（2）：140.

[3] 张 辉，田 英.鱼腥草中癸酰乙醛含量的测定[J].光谱实验室，2003，20（4）：583-5.