黄河三角洲地区PRRSV的分离鉴定及ORF4、ORF5基因遗传特性分析

吴忆春

（山东滨州职业学院生物工程学院，山东滨州256603）

黄河三角洲地区PRRSV的分离鉴定及ORF4、ORF5基因遗传特性分析

吴忆春

（山东滨州职业学院生物工程学院，山东滨州256603）

采集黄河三角洲地区某猪场发生高热症死亡的仔猪病料，处理后接种Marc－145细胞，传代2代以后出现明显细胞病变，其病毒TCID50为10－4．625／m L，采用PCR检测细胞培养物中伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒，均为阴性。采用第2代细胞培养物人工感染仔猪，仔猪出现高热、咳嗽、发绀、耳朵发紫、死亡等临床表现，剖检发病猪可见明显的间质性肺炎表现，采集肺、脾、肾和淋巴结等组织进行PCR检验，均能检测到PRRSV，初步认为分离到一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，命名为HSJ－1102株。对该分离株ORF4、ORF5基因进行扩增与克隆测序，序列分析表明，该分离株ORF4基因序列与JXA1、Ch1－a等毒株的同源性较高，在97．4%～99．3%之间，与VR2332等毒株同源性低于90%；分离株ORF5基因序列与JXA1等毒株同源性为97%～99．8%，与Ch1－a，VR2332等毒株同源性较低，分别为92．5%和86．4%。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；分离鉴定；ORF4；ORF5

自1989年首次报道猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）病例以来，PRRS已经成为影响养猪业的重庆疫病，在全世界范围内造成巨大经济损失［1］。目前，现有疫苗尚不能完全有效地控制所有或大部分猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株，这与病毒的高变异性、病毒对宿主先天免疫反应的潜在影响、猪个体免疫反应的差异性等多方面因素有关。20多年来，人们对PRRSV的感染方式、致病机制与免疫预防进行了不懈的研究，但由于PRRSV的高变异性等原因，研究过程中仍然存在着大量的难题［2－3］。本试验从黄河三角洲地区某猪场发生高热症死亡的仔猪采集病料，进行了PRRSV的分离鉴定及ORF4、ORF5基因的克隆与序列分析，为开展PRRSV遗传变异研究提供数据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 病料 2011年1月采自黄三角区某规模猪场患高热症仔猪的新鲜淋巴结、肝、肺、脾等组织样品。

1．1．2 试剂 Trizol试剂盒为Invitrogen公司产品；AMV、RNase－inhibitor、rTaq酶、d NTPs、DNA标准DL 2 000等均为宝生物工程（大连）有限公司产品；DMEM培养基等细胞培养试剂为北京清大天一有限公司产品。

1．1．3 细胞 Marc－145细胞由山东省滨州畜牧兽医研究院惠赠。

1．2 方法

1．2．1 病料处理 疑似PRRSV病猪组织，经剪碎、研磨，加入DMEM培养液配成1∶5的病料悬液，在－20℃反复冻融3次后，4 000 r／min离心10 min，取上清液，经0．22μm滤器滤过除菌后加入青霉素﹑链霉素（1 000 U／m L），4℃过夜后置－70℃保存备用。

1．2．2 病毒分离培养 将已经处理后的病料组织滤液接种于生长良好的Marc－145细胞单层，37℃吸附1 h，添加9 m L的细胞维持液（含20 m L／L小牛血清）后，在体积分数为5%CO2培养箱中37℃培养4 d～7 d，逐日观察记录细胞病变（CPE）。无病变继续传代，有病变的细胞液冻融3次后于－20℃存放备用。

1．2．3 病毒TCID50的测定 将第2代分离毒按照10－1、10－2、…10－6进行稀释后，分别接种于长满Marc－145细胞单层的96孔细胞培养板中，每个稀释度重复8个孔，每孔接种100μL病毒液，同时设阴性对照。将培养板置于37℃、在体积分数为5%CO2培养箱中培养4 d～7 d，观察细胞病变，按Reed－Muench法计算病毒的TCID50。

1．2．4 分离株的 RT－PCR检测

1．2．4．1 引物设计 根据GenBank登录的HB0706（FJ800681）株设计扩增分离株Nsp2部分序列的特异性引物，序列如下：上游引物F1：5′TTCAACCTCGAAGAACAAAGTC 3′；下游引物 F2：5′GCATGTCAACCCTATCCCAC 3′。扩增区间为2 671 bp～3 354 bp，目的片段预期大小为678 bp。

1．2．4．2 分离株总RNA的提取 采用RNA提取试剂盒进行RNA提取。

1．2．4．3 反转录体系（cDNA 的合成） 反转录酶0．5μL，5×buffer 4μL，d NTP 2μL，下游引物1 μL，模板3μL，DEPC处理超纯水9．5μL。42℃反应1 h，70℃10 min。

1．2．4．4 PCR反应体系 cDNA 模板2μL，上下游引物各0．5μL，PCR buffer 2．5μL，d NTP 2μL，r Tag酶0．5μL，加水至25μL。反应参数为：94℃5 min；94℃45 s，56℃45 s，72℃60 s，32个循环；72℃10 min，4℃结束反应。结束后将PCR产物经10 g／L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1．2．5 外源病毒排除试验 参考GenBank登录的基因序列合成3对引物，采用PCR或RT－PCR检测猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒。

1．2．6 人工感染试验 选取4周龄～5周龄PRRSV抗体阴性（用ELISA抗体检测试剂盒检测）的健康仔猪10头，攻毒组和对照组各5头，攻毒组每头猪滴鼻接种1 m L细胞分离毒（TCID50为10－4．625／m L），对照组滴鼻接种等量的 Marc－145细胞液。攻毒后隔离饲养，观察14 d，每天测量体温，观察试验猪精神和食欲。攻毒后对死亡猪剖检，采取肺、脾、肾和淋巴结等病料，用RT－PCR检测淋巴结和肺组织中的PRRSV，于攻毒后14 d将活猪全部处死，取肺、脾、肾和淋巴结等病料，用RT－PCR检测淋巴结和肺组织中的PRRSV。

1．2．7 分离株ORF4、ORF5基因的扩增与克隆测序 参考文献［4－5］设计引物，按建立的RT－PCR方法扩增ORF4、ORF5基因，用小量胶回收试剂盒纯化PCR产物，然后将其插入到p MD18－T载体多克隆位点后，构建重组质粒，筛选出阳性重组质粒交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1．2．8 HSJ－1102株 ORF4、ORF5基因序列分析

应用DNA Star 5．0软件，将获得的HSJ－1102株基因序列与 GenBank中登录的 VR2332、JXA1、Ch1－a株等PRRSV代表毒株，以及国内多地区分离毒株的ORF4、ORF5基因序列进行比对，进行相似性分析，并构建遗传进化树。

2 结果

2．1 病毒分离

疑似PRRSV病料组织无菌处理后接种于Marc－145细胞单层，37℃ 培养7 d，传2代以后，即出现CPE，表现为细胞圆缩、聚堆、脱落，形成病变灶，对照细胞无明显变化。

2．2 分离株TCID50的测定

按Reed－Muench法计算分离病毒的TCID50为10－4．625／m L。

2．3 分离株的RT－PCR鉴定结果

对Marc－145细胞分离培养物进行总RNA的提取，并利用特异引物进行RT－PCR扩增，产物经10 g／L琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增出678 bp的特异性条带，与预期的扩增产物大小相符，对照为阴性（图1）。

图1 RT－PCR检测分离病毒结果Fig．1 RT－PCR amplification of PRRSV

2．4 外源病毒排除试验

经过PCR、RT－PCR检测及细胞培养观察，该分离株不含有伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒。

2．5 人工感染试验

对照组的5头仔猪精神状态、饮食、运动、体温情况均无明显异常，而接种感染组5头仔猪均出现了不同程度呼吸系统症状，被毛粗乱、饮食减少、精神不良或沉郁，咳嗽、打喷嚏，体温升高1℃～3℃，3头仔猪出现耳根发紫，腹部发绀等现象，并与接种后14 d前死亡。剖检出现明显的间质性肺炎表现，采集肺、脾、肾和淋巴结等病料进行PCR检验，均能检测到PRRSV核酸片段。

2．6 分离株ORF4基因的扩增与序列分析

通过RT－PCR扩增ORF4基因片段，成功连接转化p MD18－T载体并测序，应用DNA Star 5．0软件对分离株的测序结果进行序列分析，并与Gen Bank上基因1型经典株VR2332株、基因2型LV株、CH1－a株，JXA1株，以及广东、黑龙江、福建、河北、北京等地的分离株ORF4序列进行核苷酸同相似分析并绘制系统进化树，分析结果表明，本毒株ORF4 基因与 HQ843180、GQ241731（山西）、EF112447（河北）、GQ359108（山东）、JXA1株等高致病性毒株遗传距离最近，与VR2332等毒株亲缘关系相对较远。核苷酸相似性分析结果表明，该分离株ORF4基因序列与JXA1，Ch1－a等毒株的相似性较高，在97．4%～99．3%之间，与VR2332等毒株相似性低于90%（图2）。

图2 PRRSV HSJ－1102株的ORF4基因系统进化树分析Fig．2 System development tree based on ORF4 gene sequence of HSJ－1102

2．7 分离株ORF5基因的扩增与序列分析

RT－PCR扩增 ORF5基因片段，连接转化p MD18－T载体并测序，应用DNA Star5．0软件对测序结果进行序列分析，并与GenBank上VR2332、LV、CH1－a、JXA1等代表毒株，以及广东、黑龙江、福建、河南、北京等地的分离株ORF5序列进行核苷酸相似性分析并绘制系统进化树，相似结果可见，分离株 HSJ－1102与基因1型相似性较高，在86．4%至97．8%，与基因2型相似性较低，为54．4%，分离株 HSJ－1102 与 CH1－a株相似性 为92．5%，与经典株 VR2332的相似性较差，为86．4%，与JXA1及广东、江苏等地区分离株相似性较高，为97%～99．8%。进化树分析可见分离株HSJ－1102属于基因1型毒株，与河南株处于同一个分支（图3）。

图3 PRRSV HSJ－1102株的ORF5基因系统进化发生树分析Fig．3 Phylogenetic tree based on ORF5 gene sequence of HSJ－1102

3 讨论

由于不同PRRSV分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异，给PRRS的准确检测和有效控制带来困难。特别是自2006年发生的以高热、高发病率和高病死率为特征的传染病以后，人们对PRRS投入了更多的关注。本研究采集黄河三角洲地区PRRS疑似病料，通过接种敏感细胞进行PRRSV分离鉴定，成功获得一株PRRSV，在 Marc－145细胞上增殖良好，能够产生明显细胞病变。通过PCR鉴定有效地排除其他病毒的存在，人工感染试验较好地复制出临床发病模型，从而证明该分离株是一株高致病性PRRSV。

在对PRRSV主要蛋白结构与功能研究中，人们对ORF4、ORF5基因编码的糖基化囊膜蛋白GP4、GP5的研究十分关注［6－7］。研究表明，GP4蛋白是一种典型的1型膜蛋白结构，包含有4个糖基化位点，C末端功能区具有糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定作用［8］。GP4糖蛋白的158至162位残基与病毒复制有关，而M162残基对于病毒感染尤为重要，GP4糖蛋白能够与细胞表面受体CD163分子在细胞膜上发挥共同作用，从而介导病毒进入细胞［9］。多项研究均报道GP4蛋白中存在PRRSV中和抗原表位，但是针对GP4的单克隆抗体的中和活性远远不如GP5单克隆抗体［10］。GP5蛋白是病毒粒子表面含量最多的糖蛋白，因此称作主要囊膜糖蛋白，GP5蛋白是受体表位识别蛋白，是能够诱导中和抗体的主要蛋白［11］。GP5蛋白和病毒膜蛋白M蛋白由二硫键相连，在病毒粒子表面形成二聚体结构，作为病毒囊膜蛋白的主要蛋白结构［12］，与GP4一起，在病毒的吸附、病毒复制、病毒装配、病毒变异和保护性反应等方面发挥着重要作用。因此本研究通过基因克隆与测序分析，获得了HSJ－1102分离株的ORF4和ORF5基因序列，并与国内外流行株、经典株进行了比较分析［13－14］。通过分析发现，本毒株ORF4 基 因 与 HQ843180、GQ241731（山 西）、EF112447（河北）、GQ359108（山东）、JXA1株等高致病性毒株遗传距离最近，尤其与GQ359108（山东）的核苷酸相似性为99．6%；本毒株ORF5基因与JXA1及广东、江苏等地区分离株相似性较高，均为97%以上，与EU200954株相似性达99．2%，因此判断HSJ－1102分离株可能是黄河三角洲地区的流行株。

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Isolation，Identification and Genetic Analysis of ORF4，ORF5 Genes of PRRSV in Huanghe Delta Area

WU Yi－chun
（BiologyEngineeringDepartment，BinzhouVocationalCollege，Binzhou，Shandong，256603，China）

One porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）strain was isolated from a sick piglet in Huanghe delta area by inoculating it into Marc－145 cells．The isolated strain can induce Marc－145 cell cytopathic effect，with TCID5010－4．625／m L．PCR based on PRRSV NSP2 gene，pseudorabies virus，classical swine fever virus，porcine circovirus showed PRRSV positive and other viruses negative．Piglets artificial infected with the second passage cell cultures showed high fever，cough，cyanosis，blue ears，and even death．Obvious interstitial pneumonia can be found during postmortem inspection．Thus the isolated virus was confirmed as a highly pathogenic strain which named HSJ－1102 strain．Genetic analysis of ORF4 showed the strain was in a branch with JXA1，Ch1－a strains，with the identity 97．4%to 99．3%．The strain was in a different branch with VR－2332 strain，the identity was lower than 90．0%．Genetic analysis of ORF5 showed the strain was in a branch with JXA1 strain，with identity 97．0%to 99．8%．The strain was in a different branch with Ch1－a and VR－2332 strains，the identity was lower than 92．5%．

PRRSV；isolation and identification；ORF4；ORF5

S852．659．6

A

1007－5038（2012）06－0037－04

2012－04－01

滨州职业学院科研项目（10xykt06）

吴忆春（1976－），女，安徽安庆人，讲师，硕士研究生，主要从事微生物学研究。