RNA 干扰及其在动物传染病方面的研究概况

杨亮宇，孙永科，，杨玉艾，王 凯，王玉娥，孔令富＊

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001）

RNA干扰是指生物体在进化过程中，由高度保守的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱导同源mRNA高效特异性降解的现象。它是生物体抵御外来感染的一种重要保护机制。RNAi作为沉默特定基因功能的新技术，为基因功能的研究提供了一个高效、简便的方法，在功能基因组学领域掀起一场革命。Science杂志在2001年将RNAi列为10大科学成就之一，2002年又将其列为当年10大科学成就之首，Nature杂志也将其评为2002年重大科技成果之一。2006年度诺贝尔生理学或医学奖奖授予两名美国科学家安德鲁-费里和克拉格-米洛，以表彰他们在RNA干扰现象发现过程中的贡献。

1 RNAi的发现

目前，有效抑制基因表达的方法主要有基因敲除（knock out）、基因表达降低（knock down）、显性阴性（dominant negative）、反义RNA（ant is en se RNA）等方法。这些方法均存在操作复杂，基因的选择局限性大且结果不稳定，无法预知试验效果等局限性。因此科学家们试图寻找更有效、易操作、结果更稳定的技术方法。

1990年Orgenson等试图将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后导入矮牵牛中，来增加花瓣的着色。然而却出现了完全相反的结果，一些转基因的花出现了全白或部分白色。这就提示，不仅导入的基因未被表达，反而连植物本身的某些合成色素的基因也失活，即出现了一种共抑制（cosuppression）现象［1］。1995年Guo和Kem Phues发现注射正义RNA和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。1998年，Fire等证实正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量内源或外源双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）而引发并将这一现象命名为RNAi，这是生物界有关RNAi存在的首次报道［2］。

2 RNAi的作用机理

经过众多学者的研究，现已基本阐明了RNAi的作用机理。一般认为dsRNA介导整个RNAi过程分为启动、效应两个主要阶段。

2.1 启动阶段

外源性dsRNA进入细胞内，首先被一种叫Dicer的酶切割成大约22nt的小干扰RNA（siRNA）片断。Dicer酶具有一个螺旋酶结构域，两个RNaseⅢ结构域和一个双链RNA结合位点，属于RNaseⅢ超家族的一员，进化上非常保守，在rde-1（RNAi defective-1）或ago-1（argonaute-1）和rde-4介导下，能特异性的切割dsRNA，产生siRNA。在此过程中，有两个需要ATP的步骤：①dsRNA的断裂，需要ATP的参与使Dicer-dsRNA复合体具有活性。②ATP维持siRNA功能所必需的靶-负链siRNA的磷酸化。siRNA是RNAi作用的重要中介因子。典型的siRNA具有5′磷酸基、3′羟基和3′外悬2nt，长21nt～23nt的双链RNA。21nt～23nt的siRNA至几百个核苷酸的dsRNA都能诱发RNAi，但长双链RNA阻断基因的表达的效果明显强于短的双链RNA。

2.2 效应阶段

RNAi的效应阶段就是siRNA降解同源mRNA的过程。siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），每个RISC含一个siRNA和一个不同于Dicer酶的RNA酶。RISC依赖ATP将siRNA解双链以激活RISC，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，并在距离siRNA 3′端12个碱基的位置切割mRNA，产生基因沉默效应。

3 RNAi的作用特点

RNAi比同源重组法更加简便，周期大大缩短。对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中起着关键作用。除此以外，RNAi还具有结构的高度稳定性、序列高度特异性、抑制作用的高效性、细胞间高传递性等，在某些生物中RNAi还可以传递到后代中去［3］。

4 RNAi在动物传染病方面的研究

自首次报道以来，RNAi技术由于其优越性而被迅速地应用于抗病毒及其相关方面的研究中。从当前的研究结果发现，RNAi针对不同基因序列都有效，而且特异性强、效率高、操作方便，可以利用特异性的siRNA技术针对病毒主要基因编码区的保守序列或与病毒感染有关内源性基因，设计出特异性的针对靶序列的siRNA，这为预防治疗病毒感染开辟了一条新途径。下面简要介绍RNAi近年来在猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、狂犬病、新城疫等重大动物传染性疾病的研究进展。

4.1 RNAi技术在猪瘟方面的研究

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物疫病。中国猪瘟兔化弱毒疫苗在防控猪瘟中曾起到决定性作用，但近几年来免疫效果不理想。猪瘟病毒（CSFV）是黄病毒科瘟病毒属的重要成员，为有囊膜病毒。CSFV基因组为单股正链RNA，全长约12kb，从5＇到3＇依次为5＇非翻泽区（5＇-NTR）、Npro、C、E0（Erns）、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B和3＇非翻译区（3＇-NTR），5＇端无帽子结构，3＇端无poly（A）尾巴。CSFV基因组编码一条由结构蛋白和非结构蛋白组成的多聚蛋白，可进一步被蛋白酶加工成病毒所需的各种功能蛋白。针对这些蛋白的功能，众多学者设计特异的siRNA，进行了抑制猪瘟病毒增殖的研究。

Npro是猪瘟病毒编码的第一个蛋白，若Npro基因表达被抑制，则整个ORF中位于Npro下游的基因将不能表达。NS5B是病毒复制酶，具有RNA依赖的RNA酶活性，是RNA聚合酶复合体的核心成分，如果猪瘟病毒的NS5B基因的表达被抑制，则会抑制病毒基因组RNA的复制。徐兴然等［5］根据猪瘟病毒Shimen株Npro和NS5B基因序列，设计猪瘟病毒特异的siRNA，通过体外转录获得了这两个基因的siRNA：siN1、siN2、si5B1和对照siCtrl，制备的siRNA转染PK-15细胞后感染猪瘟病毒，real-time RT-PCR和TCID50检测表明siN1、siN2和si5B1能有效地抑制猪瘟病毒的增殖，且其维持时间为72h～84h，72h～84h后病毒增殖才会增加。王铁东等［6］针对猪瘟病毒石门株Npro基因mRNA的shRNA（短发夹RNA）逆转录病毒表达载体，转导猪胚胎成纤维细胞，获得稳定整合shRNA表达构件的猪胚胎成纤维细胞株，接种CSFV后，间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测证实针对所构建的Npro基因的shRNA逆转录病毒整合细胞基因组后转录产生的siRNA可有效抑制CSFV复制。NS2-3基因编码的蛋白被加工后形成的p80蛋白在病毒的生命活动中起着重要的作用。冶贵生、张彦明、徐浩等［7］成功构建靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体，取得可喜进展。

近年来研究结果表明，siRNA可以作为一种候选的防治猪瘟病毒的有效制剂，虽不能清除病毒或完全抑制病毒，但通过抑制病毒快速增殖，有效激发机体免疫，可使机体及时建立特异性免疫，为研制抗CSFV新型药物提供一定的参考依据。

4.2 RNAi技术在猪繁殖与呼吸综合征方面的研究

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，呈地方流行性和持续性感染，由于PRRSV遗传变异较快，现有疫苗免疫效果较差，目前该病难以控制根除，给养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV为单股正链RNA病毒，基因组全长约为15kb，含有9个开放阅读框（open reading frames，ORFs）。其中ORF1a和ORF1b编码病毒的非结构蛋白，ORF2～ORF7编码病毒的结构蛋白。

PRRSV基因组羧基端ORF7编码核衣壳蛋白N，N蛋白是形成病毒衣壳的惟一蛋白，在组装和释放中发挥重要作用。贺云霞等［8］针对PRRSV的ORF7，设计了4个发夹结构前体（shRNA）表达盒，分别克隆在鼠U6启动子下，连入pBluscript载体，同时设立无相关序列的shRNA表达盒（pBC）作为对照。分别与pEN-7共转染293T细胞，筛选有效干扰序列，同时还使用带表达盒的PCR产物与pEN-7共转染293T细胞，结果与shRNA表达载体吻合。攻毒试验证明shRNA特异地抑制了病毒的复制，免疫荧光和定量PCR结果同样表明干扰效果显著。曹素芳等［9］针对PRRSV核衣壳蛋白N靶基因序列设计了3对siRNA靶序列，克隆到真核表达载体pSi-lencer 4.1-CMV中，构建靶向N蛋白基因表达的siRNA干扰重组的真核表达载体，并进行相应的鉴定，筛选有效的干扰序列，特异性地抑制甚至阻断PRRSV核衣壳蛋白N基因的表达，为PRRSV的新型防治技术研究奠定基础。

非糖基化的膜蛋白（M）是PRRSV主要的结构蛋白之一，与GP5蛋白形成异源二聚体，是构成PRRSV病毒囊膜蛋白的主要组成成分。黄娟等［10］通过靶向PRRSV基因组中的M基因的siRNA来抑制PRRSV在Marc-145细胞中的复制，研究证实shRNA表达质粒特异性的抑制了靶蛋白M和PRRSV的复制，靶向PRRSV基因组M基因的不同区域的siRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。

4.3 RNAi技术在禽流感方面的研究

禽流感病毒（AIV）属正黏病毒科的A型流感病毒属。AIV是单股负链RNA病毒，基因组分成8个大小不同的片段，编码不同的病毒蛋白，已鉴定出10种蛋白质。其中核壳蛋白（NP）基因、核酸聚合酶（PA）是AIV转录与复制所必需的基因，且在各型流感病毒中的序列都相当保守，是目前应用RNAi治疗AIV中最为成熟的基因靶位［11］。在体内外试验中，联合使用针对NP与PA的siRNA的抗AIV效应均已得到验证，并已有向临床发展的可能。

Ge Q等［11］用与流感病毒基因组保守区域相应的siRNAs成功的抑制了病毒在细胞或鸡胚中的增殖，为利用RNA干扰预防和治疗流感病毒奠定了基础。AIV的聚合酶由PB1、PB2、PA 3种成分组成，这3种蛋白质的共同特点是含有一段特异的亲核序列区，其作用是使这几种蛋白质在胞浆合成后能顺利进入细胞核。操胜等［12］以H5亚型AIV PB2基因为靶序列，设计合成了4对编码siRNAs的DNA序列。将其克隆到psiRNA-hH1neo载体中，构建siRNAs表达载体，鉴定正确后将重组质粒转染MDCK细胞，采用G418筛选建立抗性细胞系，在细胞水平筛选出具有高效抑制AIV复制的2个靶位点PB2-1154、PB2-342，为AIV的基因功能研究，抗病毒药物的开发和转基因动物的研究奠定了基础。

AIV的其他保守基因如：非结构蛋白（NS1）、基质蛋白1（M1）、基质蛋白2（M2），也具有RNAi的靶标的潜力。除此以外，植物产生的siRNA同样具有RNAi的作用，这为治疗动物的AIV提供了新思路与新来源［13］。

4.4 RNAi技术在新城疫方面的研究

新城疫病毒（NDV）是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，病毒RNA包裹于核衣壳结构中，病毒粒子含有6种结构蛋白，即核衣壳蛋白NP、磷蛋白P、基质蛋白M、融合蛋白F和血凝素-神经氨酸酶HN和RNA依赖的RNA聚合酶L。只有当NP、P、L这3种蛋白同时存在时才具有很高转录酶活性，同时NP、P、L基因是新城疫病毒基因组中最保守的。

母连志等［14］构建了针对新城疫病毒NDV NA-1株P基因的RNAi质粒；转染质粒36h后接种NDV，通过对病毒滴度测定、实时荧光定量PCR和细胞病变结果分析，表明其能抑制NDV在鸡胚成纤维细胞（CEF）中的复制和增殖。岳华等以NP基因为标靶构建细胞内表达发夹样结构小于扰RNA的质粒载体，在鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸡胚上进行了RNAi试验，证实在CEF中存在RNAi机制，抑制NDV NP基因的表达能有效阻断该病毒增殖。此外，胡顺林等分离具有感染性的新城疫病毒粒子后将绿色荧光蛋自基因导入新城疫病毒基因组并得到成功表达，荧光显微镜下可见明显的绿色荧光，这为进一步利用该病毒进行其它外源基因的表达及新型重组疫苗的研制奠定了基础。

4.5 RNAi技术在狂犬病方面的研究

狂犬病病毒（RV）是一种能引起人和动物高度致死性疾病的嗜神经病毒。RV基因组为不分节段的单股负链RNA，大小为12kb左右，含N、P、M、G、L 5种结构基因［15］。

狂犬病病毒siRNA研究已取得了一定进展，张守峰等［16］针对RV的G、N、L基因，设计小干扰RNA，获得2个抑制效率高的siRNA，其中有一个是针对N基因19位的siRNA；其次，Brandao P E等［17］针对RV的N基因保守区合成siRNA，用转染试剂Lipofectamine 2000瞬时转染BHK细胞，使病毒滴度比对照大约降低了5倍。

N蛋白在各病毒株间高度保守，不同株系N蛋白的氨基酸同源性在98%～99.6%。现已证实N蛋白在病毒复制过程中与RNA结合成核糖核酸蛋白（RNP），保护RNA免遭核酸酶的破坏和对病毒RNA的免疫应答，并能维护转录所需要的RNA螺旋对称结构［18］。杨瑞梅等［19］以RV的N基因为靶向目标，设计合成4对编码siRNA的DNA，转染BHK细胞，证实了靶向狂犬病病毒N基因shRNA能有效干扰RV的复制序列。王继麟等［20］分别采用体外转录和RNA酶Ⅲ消化长片段双链RNA的方法制备了8条以狂犬病毒（RV）PV株N基因作为靶基因的21nt小干扰RNA和RV-N基因小干扰RNA库，并证实不同21nt小干扰RNA均对狂犬病毒PV株产生了程度不同的强抑制作用。同时还证明在21nt小干扰RNA与靶mRNA碱基错配高达5个的情况下仍对病毒保持高抑制率。这一结果为我们提出了RNAi抑制作用的广谱性，偏靶效应等问题，并为设计独特的siRNA序列提供了依据。

5 问题与展望

当前对基因功能复杂性的认识仍然不够，尤其对外源基因表达的时空性的控制很难准确操纵，当一些蛋白的表达受抑制时，其他相关补偿途径可能被激活。Grimm D等［21］完成的一项动物试验发现，当部分试验小鼠被注射了大剂量RNAi技术中常用的短发夹RNA（shRNA）后，其细胞的正常RNA功能受到干扰，严重者甚至因此而死亡。这表明采用特定RNA干扰技术治疗的试验鼠，可能会导致肝功能衰竭死亡或产生并发症，应用RNA干扰进行基因治疗时一定要更加谨慎。有关RNAi技术安全性问题的疑虑早已存在，科学家们曾经报道，RNAi技术有可能关闭非目标基因，或者触发细胞的自身防御机制，如干扰素反应等，而这一系列副反应均有可能导致不同程度的机体损害。在应用RNAi时，应注意避免非特异性效应，加强对RNAi效应的调控，不断优化干涉dsRNA片段的获取方法和导入方式，其他方面，如RNAi抑制效果的持久性与衰减性、输入途径、病毒的免疫耐受问题等需要解决［4］。

RNAi的发现改变了人们对细胞基因调控的传统思路，提供了特异性阻断基因表达的新工具，评价基因功能的新策略，为分子生物学技术革命开辟了新领域。尽管其机制仍未完全弄清，但RNAi技术为病毒等尚未根治的疾病提供了新的治疗方案，并带来根治的希望。目前RNAi在各方面的研究已经日新月异，可以预见随着RNAi技术的逐步应用，不仅能大大推进人类后基因组计划的发展，还有可能设计出RNAi芯片，进而高通量地筛选药物靶基因和逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能［22］。今后相当长的一段时间内，RNAi是最具潜力和最热门的研究课题之一。

［1］ Guo S，Kempheus K J.Par-1，agene required for establishing polarity in C.elegans embryos，encodes a putative Ser／Thr kinase that is asymmetrically distributed［J］.Cell，1995，81：611-620.

［2］ Fire A，Xu S，Montgomery M K，et al.Potent and specific interference by double-strand RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391（6669）：806-811.

［3］ Elbashir S M，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells［J］.Nature，2001，411（6836）：494-498.

［4］ 林少微，王学华，郑高哲，等.RNAi的研究进展［J］.中国医药导报，2007，29（4）：7-9.

［5］ 徐兴然，查云峰，余兴龙，等.特异性siRNA抑制猪瘟病毒的增殖［C］。中国畜牧兽医学会2004学术年会论文集，2004：959-963.

［6］ 王铁东，逄大欣，欧阳红生，等.逆转录病毒载体RNAi技术抑制猪瘟病毒在猪胚胎成纤维细胞的增殖［J］.中国农学通报，2009，25（13）：14-17.

［7］ YE Gui-sheng，Zhang Yan-ming，Xu Hao，et al.Construction and identification of recombinant shRNA interference plasmids targeting to NS3gene of classic swine fever virus［J］.J Northwest A＆F University，2007，35（3）：7-10.

［8］ 贺云霞，华荣虹，周艳君，等.PCR扩增的shRNA表达盒快速筛选PRRSV有效siRNA序列［J］.中国预防兽医学报，2007，29（5）：376-380.

［9］ 曹素芳，李 明，王 岩，等.靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定［J］.安徽农业科学，2009，37（28）：13490-13491，13518.

［10］ Huang Juan，Jiang Ping，Li Yu-feng，et al.Inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication by short hairpin RNA targeting to M protein gene［J］.Scientia Agricultura Sinica，2008，41（1）：259-264.

［11］ Ge Q，McManus M T，Nguyen T，et al.RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100：2718-2723.

［12］ 操 胜，孟庆文，吴东来，等.通过载体表达siRNAs抑制禽流感病毒复制的研究［J］.科技导报，2006，24（3）：9-13.

［13］ Zhou Y，Chan J H，Chan A Y，et al.Transgenic plant-derived siRNAs can suppress propagation of influenza virus in mammalian cells［J］.FEBS Lett，2004，577（3）：345-350.

［14］ 母连志，丁 壮，丛彦龙，等.利用RNAi技术靶向新城疫病毒P基因抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制［J］.中国兽医学报，2009，29（7）：841-844.

［15］ 俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗［M］.北京：中国医药科技出版社，2009：215-230.

［16］ 张守峰，李清竹，李 忠，等.细胞水平狂犬病病毒感染的RNA干扰［J］.病毒学报，2006，22（6）：462-465.

［17］ Brandao P E，Castilho J G，Fahl W，et al.Short-interfering RNAs as antivirals against rabies［J］.Braz J Infect Dis，2007，11（2）：224-230.

［18］ Wunner W H，Pallatroni C，Curtis P J.Selection of genetic inhibitors of rabies virus［J］.Arch Virol，2004，l49（8）：1653-1662.

［19］ 杨瑞梅，杨松涛，王承宇，等.靶向狂犬病病毒N基因shRNA抑制狂犬病病毒复制的研究［J］.牧兽医学报，2010，41（3）：315-320.

［20］ 王继麟，朱家鸿，徐葛林，等.用狂犬病毒核蛋白基因小干扰RNA库抑制狂犬病毒复制和感染的研究［J］.中国病毒学，2006，21（3）：340-347.

［21］ Grimm D，Streetz K L，Jopling C L，et al.Fatality in mice due to oversaturation of cellular micro RNA／short hairpin RNA pathways［J］.Nature，2006，44l（7092）：537-541.

［22］ 李建霞，苗向阳，丁兆忠，等.RNA干扰技术及其应用［J］.中国农学通报，2006，22（12）：5-8.