间接ELISA 在猪瘟抗体检测上的应用

李 娇，沈志强，＊，祖立闯，王金良，谢金文

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起猪在临床上主要以稽留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为主要特征的一种高度接触性、致死性传染病［1-2］。猪瘟病毒主要通过呼吸道和消化道传染，传播速度快，发病率和病死率高，给全球养猪业带来了巨大的经济损失［3-6］。猪瘟被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，被我国列为一类动物疫病，是危害我国养猪业最严重的动物疫病之一［7］。猪瘟的诊断方法主要包括病毒的分离与鉴定、血清学及分子生物学检测方法［8］。其中，血清学检测方法是猪瘟诊断的重要手段，也是免疫猪群抗体水平监测的主要方法，对猪瘟流行状态的监测、疫苗免疫效果评价及免疫程序的制定均具有重要意义［9］。猪瘟常规的血清学检测方法主要有病毒中和试验、间接血凝试验、间接免疫荧光试验、ELISA、胶体金免疫层析等，其中间接ELISA具有简单、快捷、敏感、特异、高通量等优点，在猪瘟的抗体检测上得到了广泛应用。本文就间接ELISA方法在猪瘟抗体检测上的应用做一综述，以期为猪瘟防控提供参考。

1 间接ELISA的基本原理与特点

1971年Engvall E等［10］首先发表了应用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）进行IgG定量测定的论文。随后，ELISA成为继免疫荧光技术和放射性同位素免疫技术之后发展起来的一种新型的免疫酶技术。ELISA既可用于测定抗原，也可用于测定抗体，常用的有直接法、间接法、夹心法、竞争法（阻断法）。间接ELISA是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体（酶标二抗）检测与固相抗原结合的受检抗体（一抗），首先用特异性抗原包被固相载体，加入待测抗体（一抗），使之与固相抗原结合；再加入酶标记的抗抗体（酶标二抗），使之与待测抗体结合；再加入底物显色液，显色颜色的深浅与待测抗体的量成正比。

此方法的优点有：①检测面广，只要更换包被抗原就可利用同一个酶标二抗建立检测相应疫病抗体的方法；②检测快速，一般只要2h～3h就可以给出结果；③简单方便，操作步骤简单、对操作人员无特殊技能要求；④稳定性好，使用同一批纯化抗原、酶标抗体，具有良好的可重复性；⑤特异性强，抗原抗体的结合依赖于抗原决定簇与抗体特定化学结构和空间构型的互补关系，具有高度的专一性；⑥灵敏度高，酶的催化可极大的放大反应效果，达到很高的敏感度。此方法的缺点是：①对包被抗原的纯度要求高，间接法成功的关键在于抗原的纯度，纯度越高，特异性越强；②待检血清常含有非特异性IgG，血清总IgG中受检的特异性IgG只占小部分，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，增加试验的非特异性反应。因此，抗原包被后一般用无关蛋白质（如BSA、脱脂奶粉）再包被一次（封闭），以封闭固相载体上的空余间隙。

2 间接ELISA在猪瘟抗体检测中的应用

间接ELISA方法是目前检测猪瘟抗体的主要方法，利用猪瘟病毒抗原建立间接ELISA方法存在病毒不易培养，不易纯化，生产成本过高等不利因素，且具有潜在的散毒危险，不适合在基层单位及临床血清调查中使用。利用基因工程方法表达病毒保护性抗原基因已逐步得到重视，基因工程抗原具有安全稳定，易于生产纯化、价格低廉等优点，且重组抗原只能与病毒特定成分所诱生的抗体发生反应，可用于亚单位或标记疫苗免疫动物与自然感染动物的鉴别诊断。

CSFV基因组编码C、Erns（E0）、E1、E2 4种结构蛋白和Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B8种非结构蛋白［11］，CSFV感染后可以产生针对结构蛋白E2和E0以及非结构蛋白NS3的抗体，所以理论上检测这几种蛋白特异性抗体结果存在一致性。E2蛋白含有丰富的抗原表位，是CSFV最主要的免疫保护性抗原，能诱导高效价的中和抗体，是研制诊断试剂和基因工程标记疫苗的主要靶抗原；E0蛋白是病毒吸附进入敏感细胞的必需蛋白，具有中和表位，但只能提供部分免疫保护；NS3蛋白是一种免疫优势蛋白，含有瘟病毒群共同的抗原表位，导致NS3抗体特异性较低。目前，研制基于E2蛋白的标记疫苗是猪瘟新型疫苗研究的热点，并且已经研制多种基于E2蛋白的基因工程标记疫苗［12］。应用E2蛋白标记疫苗后，可以用另外一种病毒蛋白（E0或NS3）来进行标记疫苗免疫与自然感染野毒产生抗体的血清学鉴别诊断，从而便于从免疫猪群中淘汰净化强毒感染猪，减少未感染的免疫猪被误杀的可能。

2.1 基于E2蛋白的猪瘟抗体间接ELISA检测方法

囊膜蛋白E2是CSFV中免疫功能最重要的蛋白，携带有能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇，可诱导动物机体产生保护性的中和抗体，是近年来研制新型疫苗和血清学诊断抗原以及研究CSFV抗原变异的主要对象［13］。通过对E2蛋白的抗原结构分析证实，E2蛋白包括4个相对独立的抗原结构域（A、B、C、D），诱导机体产生中和抗体的表位被定位在抗原结构域A、B和C［14］。

尹双辉等［15］将猪瘟疫苗毒株E2基因主要抗原区（A-D）基因克隆到表达载体pGEX-6p-1，转化E.coli，降低诱导温度至20℃，获得48Ku大小的E2融合蛋白，部分目的蛋白以可溶性形式表达。Western blot试验证实E2融合蛋白可以和CSFV阳性血清发生特异性结合。以亲和层析纯化后的E2融合蛋白作为抗原，建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA方法。该方法与PRRSV、PCV-2、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应，用该方法和国外同类试剂盒（CSF-Ab-Kit）同时检测142份田间血清样品，2种试剂盒的阳性检测率分别为83.81%和88.73%。该方法通过降低重组蛋白的诱导温度，促进了E2蛋白以可溶性的形式表达，避免了包涵体变性和复性复杂过程，且利用亲和层析纯化E2蛋白操作过程简单，抗原纯度好，建立的间接ELISA方法操作简便、快速、敏感性高、特异性强，可作为猪瘟临床大规模血清学调查的诊断方法，为间接ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础，为评价猪瘟疫苗效果和猪瘟综合控制提供了技术手段。谢金文等［16］参照已发表的CSFV C株基因组序列，应用RT-PCR扩增了包含A、B、C、D共4个中和抗原区在内约786bp的E2基因片段，将目的片段定向克隆到pET30a原核表达载体，转化BL21表达菌，经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组E2蛋白，采用镍离子亲和层析纯化重组蛋白，经免疫印迹检测证明纯化具有良好的抗原性和特异性。以该纯化蛋白为包被抗原，初步建立了CSFV间接ELISA检测方法。李娇等［17］在此基础上，以纯化的CSFV重组E2蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白（HRP-SPA）为酶标二抗，研制了检测CSFV抗体的PPA-ELISA诊断试剂盒。该试剂盒与其他7种常见猪病病毒（PRRSV、PPV、JEV、PCV-2、PEDV、PRV、TGEV）的阳性血清不发生交叉反应；批内重复性试验的变异系数小于5%，批间重复性试验的变异系数小于10%；与间接血凝试验相比较，符合率、敏感性和特异性分别为86.2%、85.4%和87.2%；与IDEXX ELISA试剂盒相比较，符合率、敏感性和特异性分别为91.3%、93.2%和88.7%。该E2-PPAELISA抗体检测试剂盒具有良好的重复性、敏感性和特异性，为CSF的快速诊断、疫苗免疫猪群抗体监测和CSF流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断试剂盒，适合基层兽医单位广泛推广应用。

2.2 基于E0蛋白的猪瘟抗体间接ELISA检测方法

糖蛋白E0是CSFV包膜蛋白与核酸酶，也是病毒吸附进入敏感细胞的必需蛋白，其活性对病毒在宿主体内的持续感染有直接关系，为诱导机体产生中和抗体的保护性抗原之一［18］。目前，研究的CSFV基因工程疫苗主要以E2蛋白为抗原，基于CSFV E0蛋白建立相应的抗体检测技术对监测猪瘟的流行情况，区分E2标记疫苗免疫猪和野毒感染猪均具有重要意义。

贾洪林等［19］将大肠埃希菌表达的CSFV重组E0蛋白经纯化后作为包被抗原，建立了检测猪瘟抗体的E0-ELISA方法，确定了最适抗原包被量为0.15μg，血清最适稀释度为1∶100。该方法检测PRRSV、PRV、PCV2、PPV、TGEV、PDEV阳性血清均为阴性。对高、中、低效价的3份猪瘟阳性血清进行E0-ELISA检测后，板内变异系数与板间变异系数均低于10%。与基于重组E2蛋白的E2-ELISA的符合率高达96.7%，与基于全病毒抗原的Dot-ELISA符合率为77.5%。该方法简便、特异、稳定，可以用于猪瘟抗体的血清学监测以及用作基于E2蛋白的标记疫苗配套的鉴别诊断。李鹏等［20］将CSFV野毒株FJ237-E0基因插入原核表达载体pET32a中，以BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达，表达的E0蛋白分子质量约为50.3ku，为可溶性蛋白，表达量占菌体总蛋白的30%，将表达的重组蛋白通过His亲和层析柱进行纯化，以纯化的E0融合蛋白作为诊断抗原，通过ELISA方阵确定的最佳抗原包被量为100ng，血清稀释倍数为1∶30，建立检测猪瘟E0抗体的ELISA方法与IDEXX公司猪瘟病毒抗体检测试剂盒的阳性符合率为92.3%，阴性符合率为85.7%。该方法的建立不但为猪瘟抗体监测提供了一种比较实用的血清学监测手段，也为进一步开发诊断猪瘟抗体的检测试剂盒及研制标记疫苗所需的配套诊断试剂奠定基础。吴素丽等［21］扩增克隆E0基因，插入原核表达载体pET32a，转化进BL2l（DE3）内进行表达。将表达的重组pET-E0蛋白通过His亲和层析柱纯化，以纯化后的蛋白为诊断抗原，包被96孔聚乙烯平板，建立检测猪瘟E0抗体的ELISA方法。分别使用IDEXX猪瘟抗体ELISA试剂盒检测和该ELISA方法检测200份临床血清样品，IDEXX试剂盒检出阳性血清186份，E0-ELISA检出阳性血清154份，两者符合率为83%。E0-ELISA在标记疫苗的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能，对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用。

2.3 基于NS3蛋白的猪瘟抗体间接ELISA检测方法

CSFV非结构蛋白NS3蛋白是该病毒最保守的蛋白之一，是瘟病毒引起细胞病变作用主要因子，是病毒复制增殖必需蛋白，在动物体体内能产生不同程度的抗体［22-23］。以NS3蛋白为抗原建立间接ELISA可以作为CSF的血清学鉴别诊断方法。

蒋大良等［24］将NS3基因克隆至原核表达载体pET-32a，构建成重组原核表达载体pET-NS3，在大肠埃希菌Rosetta（DE3）中进行优化表达，SDSPAGE分析重组蛋白NS3以包涵体形式表达，Western blot分析表明重组蛋白NS3具有良好的免疫原性，采用Ni＋亲和层析方法纯化重组蛋白，以纯化的重组蛋白NS3为抗原建立了检测CSFV NS3抗体的间接ELISA方法，应用该方法和IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒同时检测221份不同猪群和年龄猪的血清样品，二者阳性符合率为83.33%，阴性符合率为89.38%，总符合率为86.43%。对30份存在差异的血清样品用间接免疫荧光法（IFA）进行检测，结果显示IFA检测结果与NS3-ELISA和IDEXX CSFV-Ab检测试剂盒符合率分别为56.67%和43.33%。该检测方法与IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒和IFA检测结果存在较高的一致性，具有较好的可重复性，可以作为CSF血清学诊断方法。

3 结语

我国现阶段猪瘟流行形势复杂，没有明显规律性，猪瘟仍是我国动物疫病防控的一大难题，防控任务艰巨。CSFV特异性抗体的检测对于评价弱毒疫苗免疫效果和控制猪瘟有着非常重要的现实意义。间接ELISA以其灵敏、特异、简单、快速、稳定、高通量及易于操作等优点，为CSFV的诊断提供了新的模式。目前，国内学者已经建立了多种猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法，并得到了良好的应用效果。相信随着基因体外表达技术的不断深入与发展，间接ELISA操作技术的日趋成熟和完善，间接ELISA试剂盒的不断研制与组装，间接ELISA在猪瘟的检测上将会有更加广阔的应用前景，将为猪瘟的预防和控制提供合理的科学依据。

［1］ Moennig V，Floegel-Niesmann G，Greiser-Wilke I.Clinical signs and epidemiology of classical swine fever：a review of new knowledge［J］.Vet J，2003，165（1）：1-2.

［2］ 李娇，祖立闯，沈志强，等.单克隆抗体在猪瘟诊断上的应用［J］.畜牧与兽医，2011，43（8）：88-92.

［3］ David D，Edri N，Yakobson B A，et al.Emergence of classical swine fever virus in Israel in 2009［J］.Vet J，2011，190（2）：146-149.

［4］ Nandi S，Muthuchelvan D，Ahuja A，et al.Prevalence of classical swine fever virus in India：a 6-year study（2004-2010）［J］.Transbound Emerg Dis，2011，58（5）：461-463.

［5］ Leifer I，Hoffmann B，Hper D，et al.Molecular epidemiology of current classical swine fever virus isolates of wild boar in Germany［J］.J Gen Virol，2010，91（11）：2687-2697.

［6］ Backer JA，Brouwer H，van Schaik G，et al.Using mortality data for early detection of classical swine fever in The Nether-lands［J］.Prev Vet Med，2011，99（1）：38-47.

［7］ 董 浩，李 菲，王 鑫，等.猪瘟病毒野毒株与疫苗株酶切检测方法的建立、优化及应用［J］.中国畜牧兽医，2011，38（9）：187-189.

［8］ 李 菲，赵立峰，高云航，等.猪瘟分子生物学诊断新进展［J］.中国畜牧兽医，2010，37（6）：168-170.

［9］ 庞 然，张小敏，周 斌，等.4种商品化试剂盒检测猪瘟病毒抗体的比较分析［J］.中国兽医杂志，2011，47（9）：40-42.

［10］ Engvall E，Perlmann P.Enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa.3.Quantitation of specific antibodies by enzymelabeled anti-immunoglobulin in antigen-coated tubes［J］.J Immunol，1972，109（1）：129-135.

［11］ Riedel C，Lamp B，Heimann M，et al.Characterization of essential domains and plasticity of the classical Swine Fever virus core protein［J］.Virol Sin，2010，25（1）：71-76.

［12］ 邹海涛，兰邹然，姜 平，等.猪瘟标记疫苗研究现状［J］.动物医学进展，2011，32（11）：111-115.

［13］ Fernández-Sainz I，Holinka L G，Gladue D，et al.Substitution of specific cysteine residues in the E1glycoprotein of classical swine fever virus strain Brescia affects formation of E1-E2heterodimers and alters virulence in swine［J］.J Virol，2011，85（14）：7264-7272.

［14］ Chang C Y，Huang C C，Lin Y J，et al.Identification of antigen-specific residues on E2glycoprotein of classical swine fever virus［J］.Virus Res，2010，52（1-2）：65-72.

［15］ 尹双辉，尚佑军，刘艳红，等.可溶性E2蛋白作为抗原的检测猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法的建立［J］.中国兽医学报，2009，29（12）：1529-1533.

［16］ 谢金文，李 娇，董 林，等.猪瘟病毒E2基因原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立［J］.中国兽医杂志，2011，47（3）：28-30.

［17］ 李 娇，王金良，祖立闯，等.猪瘟病毒重组E2蛋白PPAELISA抗体检测试剂盒的研制及应用［J］.中国兽医学报，2011，31（10）：1390-1394.

［18］ Gavrilov B K，Rogers K，Fernandez-Sainz I J，et al.Effects of glycosylation on antigenicity and immunogenicity of classical swine fever virus envelope proteins［J］.Virology，2011，420（2）：135-145.

［19］ 贾洪林，仇华吉，朱庆虎，等.基于重组Erns蛋白的猪瘟Erns-ELISA的建立和优化［J］.畜牧兽医学报，2005，36（10）：1028-1032.

［20］ 李 鹏，张彦明，张 志，等.猪瘟流行毒株E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立［J］.西北农林科技大学学报：自然科学版，2008，36（10）：24-28.

［21］ 吴素丽，孙惠玲，钱永华.猪瘟病毒E0蛋白的高效表达及其间接EL ISA检测方法的建立［J］.动物医学进展，2009，30（8）：13-18.

［22］ Lamp B，Riedel C，Roman-Sosa G，et al.Biosynthesis of classical swine fever virus nonstructural proteins［J］.J Virol，2011，85（7）：3607-3620.

［23］ Zhu Z，Wang Y，Yu J，et al.Classical swine fever virus NS3 is an IRES-binding protein and increases IRES-dependent translation［J］.Virus Res，2010，153（1）：106-112.

［24］ 蒋大良，余兴龙，李润成，等.猪瘟病毒NS3基因克隆、原核表达及间接ELISA方法初步建立［J］.微生物学通报，2010，37（1）：78-84.