用HPLC法测定人血浆中美罗培南的浓度

陈晓晶，梁海涛，覃韦苇，李中东＊，徐一新

（1.上海健康职业技术学院药学教研室，上海200237；2.复旦大学附属华山医院药剂科，上海200040）

美罗培南是一种具有广谱抗菌活性的碳青霉烯类抗生素，通过抑制细菌细胞壁的合成而产生抗菌作用。该药常用于治疗致病菌不明的感染，或者由单一或多种细菌引起的成人及儿童的各类重症感染，例如复杂性腹腔感染、医院获得性肺炎、严重的社区获得性肺炎、伴囊性纤维化症的肺部感染、细菌性脑膜炎、败血症等［1］。虽然美罗培南中枢神经系统（CNS）安全性好，神经毒性低于亚胺培南／西司他汀钠，但是肾功能受损的病人使用美罗培南，仍可能出现严重的CNS不良反应。因此对于肾功能受损的病人，应该根据不同病人的药动学特征减少美罗培南的剂量或延长给药间隔［2］。

本研究旨在建立测定人血浆中美罗培南的HPLC－UV法，为其药动学研究和临床血药浓度监测提供参考，促进临床合理、安全使用美罗培南。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、柱温箱、自动进样器、Waters 2487型双波长紫外检测器、Millennium 32色谱数据工作站（美国Waters公司）；Sigma 3k－15型高速离心机（德国Sigma公司）；Millivac小型真空泵（美国Millipore公司）；Bond Elut固相萃取小柱（C 2，100mg，1ml，美国Varian公司）；VacMaster－20型半自动真空固相萃取装置（美国VacMaster公司）；BP－211D十万分之一分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 药品和试剂 美罗培南标准品（纯度87%，批号130506－200702）；氢氯噻嗪对照品（纯度＞98%，批号100309－200702，中国食品药品检定研究院）。甲醇（色谱纯，美国Promptar公司）；磷酸二氢钾（分析纯，汕头金砂化工厂有限公司）；甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；三乙胺（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；纯化水由Milli－Q超纯水器（美国Millipore公司）制备。空白血浆由复旦大学附属华山医院血库提供。

2 方法和结果

2.1 溶液的配制 精密称取美罗培南标准品适量，用水溶解并配制成浓度为1.00mg／ml的储备液；用甲醇∶水（50∶50）稀释此储备液，配制成浓度为750、250、100、25、10、5μg／ml的美罗培南系列标准品溶液，置4℃冰箱保存备用。

精密称取内标氢氯噻嗪对照品适量，置10ml容量瓶中，用水溶解并配制成浓度为1.00mg／ml的储备液；用甲醇∶水（50∶50）稀释此储备液，配制成浓度为500μg／ml的氢氯噻嗪内标工作溶液，置于4℃冰箱保存备用。

2.2 血浆样品预处理 Bond Elut固相萃取柱预先用1ml甲醇和1ml纯化水依次处理。取200μl血浆样品，加入50μl的氢氯噻嗪内标溶液，涡旋混匀后过固相萃取柱，用0.5ml浓度为5mmol／L的磷酸二氢钾溶液（pH 6）洗涤，真空抽滤至固相萃取柱床干燥，弃去滤液。然后用0.5ml甲醇－0.1%甲酸（15∶85）洗脱。洗脱液经1.15×104×g离心5min，取上清液进样分析。

2.3 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）；流动相：5mmol／L磷酸二氢钾溶液（pH 6）－甲醇（15∶85）；柱温：40℃；流速：1ml／min；检测波长：298nm；进样量：40μl；内标物：氢氯噻嗪。

2.4 方法专属性 分别取6份不同来源的空白血浆200μl，制备不含美罗培南和氢氯噻嗪的空白血浆阴性对照，按2.2项下方法操作，即得。与含有美罗培南、氢氯噻嗪的血浆样品比较，由图1可见，美罗培南、氢氯噻嗪保留时间分别为7.2和6.1min，两者分离良好，血中内源性物质不干扰样品测定。

图1 人血浆中美罗培南和内标的HPLC谱图

2.5 标准曲线与定量下限 取空白血浆200μl，精密量取美罗培南系列标准品溶液适量，分别配制美罗培南浓度为75、25、10、2.5、1.0、0.5μg／ml的血浆样品，按2.2项下方法处理，每一浓度进行双样本分析。以待测物色谱峰面积与内标色谱峰面积比（Y）为纵坐标，待测物浓度（X）为横坐标，用加权（W＝1／x2）最小二乘法进行回归计算，回归方程为Y＝0.123 1 X＋0.046 01，r＝0.998 0。美罗培南在0.5～75μg／ml内的线性关系良好。定量下限可达0.5μg／ml。

2.6 精密度实验 取空白血浆200μl，精密量取美罗培南系列标准品溶液适量，分别配制美罗培南浓度为40、10、1.5μg／ml 3种不同浓度的血浆样品，按2.2项下方法处理后进行色谱分析，在一个分析批内测定6次，计算批内精密度。在不同日连续制备并测定3个分析批次，计算批间精密度。计算得到批间精密度RSD＜12.7%（n＝3），批内精密度RSD＜11.4%（n＝6）。

2.7 回收率实验 取空白血浆200μl，按2.1项下方法分别制备低、中、高浓度（美罗培南浓度分别为1.5、10、40μg／ml）血浆样品，按2.2项下方法处理后进样分析，每一浓度进行6样本分析。同时用流动相配制相同浓度的美罗培南和氢氯噻嗪内标混合溶液。分别进样分析，以每一浓度两种处理方法的峰面积的比值计算回收率。结果表明，低、中、高浓度美罗培南的回收率分别为（90.5±8.7）%、（86.8±8.4）%和（91.7±7.9）%（n＝6）。

2.8 稳定性考察 测定血浆样品在室温放置2h、－70℃冰箱放置10d、－20℃冰箱反复冻融3次，以及样品处理后在自动进样器内4℃放置12h的稳定性，每一种浓度平行操作3次。结果见表1。由表1可见，样品在考察的放置条件下稳定。

表1 血浆中美罗培南在不同条件下的稳定性实验结果（n＝3，ρB／μg·ml－1）

3 讨 论

文献报道测定人血中美罗培南的方法，分别采用了沉淀蛋白质、超滤后直接进样等样品前处理方法［3－5］。沉淀蛋白质法以乙腈沉淀蛋白质后采用二氯甲烷清洗上清液，步骤繁琐，并且二氯甲烷毒性较大，对人体和环境有一定的危害。超滤后直接进样的方法需要特殊的仪器设备。本研究参考文献报道的固相萃取法处理样品［6］，并做了改进，选择了适当的内标，减少了血浆样品体积，保证了固相萃取处理过程和测定过程的可控性和准确性，减少了病人采血的痛苦。

据文献报道，健康志愿者单次静脉滴注美罗培南0.5g后，血浆峰浓度为（21.1±10.7）μg／ml［7］。连续性肾脏替代治疗病人静脉滴注美罗培南1.0g后，血浆峰浓度为（48.5±12.3）μg／ml［5］。烧伤病人静脉滴注美罗培南0.5g后，血浆峰浓度为（36.4±10.5）μg／ml［8］。本方法可以在0.5～75μg／ml的线性范围内准确、快速测定血浆中的美罗培南，能够满足美罗培南人体药动学研究的需要。

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