星点设计－响应面法优选肺炎口服液的提取工艺

梁喆，张丽，吕艳莉，陈惠铮

(1．哈尔滨市儿童医院，黑龙江 哈尔滨 150010;2．黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

大黄牡丹汤为张仲景《金匮要略》中的一首名方，而肺炎口服液为大黄牡丹汤的加减方，方由石膏、甘草、绵马贯众、牡丹皮、芦根、大黄、钩藤、板蓝根、地骨皮、蒲公英10味中药组成，具清热解毒、止咳定喘的功效，主治肺热壅盛型病毒性肺炎、气管炎。肺炎口服液是哈尔滨市儿童医院特色中药制剂，方中大黄泻火逐瘀，通便解毒;牡丹皮凉血清热，活血散瘀，二者合用，共泻肠腑湿热瘀结，共为方中君药，且符合中医肺与大肠相表里的理论。

中药的提取及制备工艺最常用的优化方法是正交设计法［1］和均匀设计法［2］，但是这两种方法存在一定的不足。星点设计－效应面法作为优选工艺的方法之一，弥补了正交设计法和均匀设计法的缺限，在国内外广泛运用［3－6］。星点设计(Central Composite Design，CCD)采用线性或非线性拟合的实验设计方法，可以减少试验次数、并且提高了试验的精密度。响应面分析法(Response Surface Methodology，RSM)是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间函数关系的一种统计方法，通过对响应面等值线的分析以寻求最优工艺参数。本实验以大黄酸、丹皮酚和芍药苷的含量为指标，采用3因素5水平的星点设计表安排提取工艺实验，结合响应面法优选处方的提取工艺，为新剂型的开发提供依据。

1 仪器与试药

1．1 仪器

美国Waters高效液相色谱仪(2695溶剂管理系统，2996二极管阵列检测器，美国Waters柱温箱，Empower2工作站);PTHW型电子恒温电热套(巩义市予华仪器有限公司);FA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司);DZG6050SA真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司);KQ－50B超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

1．2 药品与试剂

芍药苷(110736－200933)、丹皮酚(110708－200506)、大黄酸对照品(0757－200206)(中国药品生物制品检定所);石膏、甘草、牡丹皮、大黄等10味药材(哈药集团世一堂饮片厂，经黑龙江中医药大学刘树民教授检验，均符合《中国药典》2010年版一部规定);水为重蒸水;甲醇(色谱纯，天津四友试剂厂);其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2．1 芍药苷、丹皮酚含量测定方法［7］

2．1．1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18色谱柱(4.6mm ×150mm，5μm);柱温:40℃;流动相:甲醇 －0.05%磷酸水溶液系统，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1;流速:1．0ml/min;进样量:10μl;检测波长:芍药苷230nm，丹皮酚274nm。此条件下芍药苷和丹皮酚色谱峰与相邻成分可达基线分离。

表1 梯度洗脱时间程序

2．1．2 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷和丹皮酚对照品，加甲醇制成每1m l分别含芍药苷0.156mg、丹皮酚0.301mg的混合溶液，作为对照品溶液。

2．1．3 供试品溶液的制备 取本品内容物约20ml，精密量取，置圆底烧瓶中，蒸发溶剂至干，残渣加甲醇5m l溶解，并转移至10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得。

2．2 大黄酸含量测定方法［8］

2．2．1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18柱(4.6mm×150mm，5μm);柱温:30℃;流动相:甲醇 －0.1%磷酸溶液(85∶15);流速为 1．0ml/min;检测波长:254nm;进样量:10μl。

2．2．2 对照品溶液的制备 精密称取大黄酸对照品适量，置10ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制成浓度为0.175mg/ml的溶液。

2．2．3 供试品溶液的制备 取本品内容物约20ml，精密量取，置圆底烧瓶中，蒸发溶剂至干，残渣加2.5mol/l硫酸溶液20ml，置水浴中加热回流2h，放冷，加氯仿20ml，回流30min，转移至分液漏斗中，分取氯仿液，滤过，酸液再加氯仿提取3次，每次20ml，分别滤过氯仿液，最后用氯仿10ml分次洗涤滤器，合并氯仿液和洗液，加水30ml洗涤氯仿液，弃去水洗液，氯仿液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，并转移至10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得。

2．3 星点试验设计

根据工业化生产的实际，本实验采用水提取法。实验中提取次数和药材粒径为非连续变量，回归处理困难，因此本试验固定提取次数为2次，药材粒径以通过3号筛为准。根据预试验结果，选择醇沉浓度(X1)、料液比(X2)和提取时间(X3)3个因素为自变量，其中醇沉时的乙醇体积固定，料液比和提取时间主要是针对水提取工艺设计的因素，每个因素确定5个水平，共20个试验点(6个中心点)，以芍药苷、丹皮酚和大黄酸含量的总和作因变量考察指标，采用星点设计提取工艺条件，运用响应面分析法分析以寻求最优工艺参数，因素水平编码见表2，试验安排和结果见表3。

表2 提取工艺因素水平编码

2．4 数据分析 应用Design－Expert7．0．0软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到醇沉浓度(X1)、料液比(X2)及提取时间(X3)与提取物总含量之间的二次多项回归方程，回归方程为:

Y=4．97+0．88X1+1．19X2+0．39X3+0．025X1X2+0．098X1X3+0．1X2X3+1．03X21+0．85X22+0.91X23

回归方程系数 r2=0．947 5(r=0．973 3)，说明模型能解释97．33%响应值的变化，表明该回归模型的拟合情况良好，回归方程的代表性较好，能准确的预测实际情况。其校正决定系数(adj－R2)为0．900 2(r=0.948 7)，表明此模型能解释94．87%效应值变化，因此该模型拟合程度良好。

对上述回归模型进行显著性检验，结果见表3。表3回归方程显著性检验，P＜0.000 1，回归方差显著性检验表明，一次项醇沉浓度(X1)和料液比(X2)对提取物总含量的线性效应极显著(P＜0.01);一次项提取时间(X3)，二次项中 X21，X22，X23对提取物总含量的曲面效应显著(P＜0.05);醇沉浓度(X1)和料液比(X2)交互项(X1X2)、醇沉浓度(X1)和提取时间(X3)交互项(X1X3)、料液比(X2)和提取时间(X3)交互项(X2X3)的P值均大于0.05，说明各因素间的交互作用不显著。

表3 星点试验设计与结果

2．5 响应面分析及最优提取条件的确定 依据回归方程，在保持1个因素编码值为0时，借助Design－Expert7．0．0软件绘制其它2个因素与响应值关系的三维响应面图，结果见图1。由图可以看出，醇沉浓度(X1)和料液比(X2)对提取物总含量的提取影响较为显著，且响应曲面陡峭。

为确定这三个影响因素的最佳取值，通过Design－Expert7．0．0软件分析，得出回归模型存在最大值点，(X)的代码值分别为0.02，－1.18，－1.40，与之对应的实测值醇沉浓度(X1)为75.76%，料液比(X2)为1∶9.19，提取时间(X3)为2.08h，此时肺炎口服液中提取物总含量的最大估计值为10.46mg/ml。

2．6 模型的验证 为了验证此提取模型方程的适用性，在醇沉浓度、料液比、提取时间最优的水平上，重复试验 3次，提取物总含量为 10．38mg/ml(RSD为0.37%)，与预测值10.46mg/ml吻合极好，说明用此模型指导实践具有非常好的效果。

表3 回归模型方差分析

图1 各因素与响应值关系的三维响应面图

3 讨论

由于星点设计－响应面优化法采用非线性模型拟合，在中心点进行重复性实验的次数越多，越可以提高实验的精确度，预测值越可接近真实值，故本实验采用6次重复试验。实验方法简便合理、稳定，可预测性较优。

根据口服液生产的实际，本提取工艺还考察了醇沉浓度对于药效成分的影响。结果表明，醇沉浓度对于口服液生产的质量有很大的影响。

本试验采用响应面分析法确定了星点设计优化的肺炎口服液提取工艺的最优条件:醇沉浓度(X1)为75.76%，料液比(X2)为 1∶9.19，提取时间(X3)为2.08h，在此条件下，肺炎口服液中提取物总含量的最大估计值为10.46mg/ml，试验结果与模型预测值相符。

［1］魏小亮，胡久梅，毛霞．正交设计法优选川芎挥发油的β－环糊精包合工艺［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(5):46．

［2］廖国平，贺帅，张忠义．均匀设计法优化超高压提取虎杖中虎杖苷和白藜芦醇［J］．中国中药杂志，2010，35(24):3282．

［3］徐秀泉，许源，汤建，等．响应面法优化金莲花总黄酮的超声提取工艺［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(14):35．

［4］陈卫卫，彭晶蕊，杨黎，等．星点设计－效应面法优选消疮颗粒剂的提取工艺［J］．辽宁中医杂志杂志，2009，36(7):1188．

［5］张良蕾，姚倩，陈开晓，等．星点设计效应面法优化槐花米中槲皮素提取工艺［J］．时珍国医国药，2010，21(8):2068．

［6］李晶，张洪霞，朱鸿敏，等．星点设计－效应面法优化升阳散火汤提取工艺［J］．沈阳药科大学学报，2010，27(5):392．

［7］李向阳，屠万倩，张留记．RP－HPLC法测定不同产地的牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的含量［J］．中药新药与临床药理，2011，22(5):563．

［8］中华人民共和国药典委员会．中华人民共和国药典［S］．北京:中国医药科技出版社，2010:22．