MTT法检测香叶木苷对脐静脉内皮细胞增殖抑制的影响

苏秀莉，卢卫红，张浩，赵越

(哈尔滨工业大学，黑龙江 哈尔滨 150001)

香叶木苷(dosmin，3'，5，7 － 三羟基 4'－ 甲氧基黄酮－7－芸香糖)是从茜草科药用植物蓬子菜(Galium verum L．)中提取出的含量丰富黄酮苷类化合物［1］，蓬子菜是中国东北的一种野生植物，这种植物以维生素的优良的食物来源而著称，它还包含绿原酸，水杨酸和黄酮类等物质，在东北民间药用历史悠久，具有清热祛湿、活血止痒的功效，近10余年来，临床应用不同剂型治疗下肢静脉炎疗效显著。香叶木苷具有增加静脉张力，改善静脉通透性，改善微循环的作用，从而减轻肢体水肿，在国内已有多篇文献临床报道［2－4］。香叶木苷具有消炎和止痛的药效，柑橘中获得的类黄酮香叶木苷具有抗虐、抑制癌细胞增殖作用，还可以作为中枢神经镇静剂并具有辅助睡眠，缩短入睡时间的显著功效，同时它还是治疗疾病的特殊药效物质，可以增加肌肉强度，抵抗静脉血管炎症，慢性血管炎，风湿病关节炎，抗氧化，抗脂质过氧化的功效，细胞保护，治疗急性和慢性的胃溃疡和十二指肠溃疡［5－7］。本课题组前期实验从蓬子菜中分离了香叶木苷，并且进行了香叶木苷在大鼠体内的药代动力学等研究［8］。

脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，简称HUVECs)是一种干细胞，能无限次传代(理论上)，易于实验操作。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。最终结果在490nm波长处测定其光吸收值，按下面公式计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(IR)=(1－加药组吸光度/对照组吸光度)×100%。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

香叶木苷的研究前期主要集中在从蓬子菜中分离提取纯化及在动物体内的功能，几乎没有作用于细胞方面的研究，本实验从香叶木苷作用于脐静脉内皮细胞入手，优化出最佳加药浓度和最优加药实验，为后期研究相关香叶木苷作用于细胞的蛋白质组研究奠定基础。

1 材料

1．1 细胞来源 人脐静脉内皮细胞株由哈尔滨医科大学提供。

1．2 药材与试剂 香叶木苷(由蓬子菜分离提取，蓬子菜采自黑龙江省镜泊湖地区和哈尔滨郊区，由黑龙江中医药大学药学院于加宾教授鉴定，香叶木苷由哈尔滨工业大学卢卫红副教授分离提取［9］);改良型RPMI－1640培养基、胎牛血清和胰蛋白酶(美国HyClone公司);四甲基偶氮唑蓝(美国Amresco公司);二甲基亚砜(DMSO)(美国Amresco公司);青－链霉素(碧云天公司)。

2 方法

2．1 培养基的配置 H－1640培养基按照90%RPMI－1640培养基、10%胎牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL比例配置。配置好的培养基封口放入4°冰箱保存。

2．2 脐静脉内皮细胞的复苏及培养 将冻存细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中并轻轻晃动使其迅速融化，立即放入离心机离心(1 000r/min，5min)，吸去上层液体，加入1ml培养基轻轻吹打，使细胞分散成单个，转移至25cm2培养瓶中，再补加入1mL培养基，放入37℃，CO2体积分数为5%的温箱中培养。24h后更换培养基，除去未贴壁的细胞，2～3天更换培养基［10］。脐静脉内皮细胞的传代培养:用胰蛋白酶EDTA消化法。待细胞融合成单层后，弃去旧培养液，用PBS液洗涤瓶壁，加2mL，25g/L胰蛋白酶，作用1min后吸去消化液，室温下继续作用，一边在倒置显微镜下观察，直到细胞皱缩、彼此分离或单层细胞出现网孔状即可终止消化。加入培养液，吸管吹打，制成细胞悬液，按1∶2比例将细胞悬液接种于培养瓶中，置CO2体积分数为5%的培养箱中，37℃培养。待长满单层，用同法继续传代培养［10］。

2．3 最优药物浓度的选择 设置10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL 六个药物浓度组及对照组。按1×105个/mL密度接种细胞于96孔板中，每孔100μL，每种浓度设4孔重复，边缘空白孔加PBS保持湿度。于培养箱中培养12h，待细胞贴壁后按照分组加入药物，24h后每孔加入20μLMTT，置于CO2体积分数为5%，温度为37℃的条件下继续培养4h，弃上清，每孔加150μl DMSO，于摇床上摇10min，酶标仪上以490nm波长测定吸光度。

2．4 最优加药时间的确定 将细胞按1×105个/mL密度接种细胞于96孔板中，每孔100μL，共三组，分别标注为A(24h)、B(48h)和C(72h)，每组4孔重复并设置对照组。于培养箱中培养12h后选择上述实验优化出的最佳药物浓度加药，24h后取出A组每孔加入20μLMTT，置于CO2体积分数为5%，温度为37℃的条件下继续培养4h，弃上清，每孔加150μL DMSO，于摇床上摇10min，酶标仪上于490nm波长测定吸光度。B和C组分别于48h和72h后进行相同处理。

3 结果

3．1 最优药物浓度为20μg/mL 24h后进行MTT检测得到的结果如图2。最优药物浓度为20μg/mL，而对照组的OD值为0．905，低于20μg/mL加药组的结果，说明这个浓度的香叶木苷对细胞的生长有促进作用。

3．2 最优加药时间为48h 经MTT检测后得到图3的结果，证明48h是最优加药时间。

图1 不同浓度药物对脐静脉内皮细胞的影响

图2 不同加药时间对脐静脉内皮细胞的影响

表1 不同浓度香叶木苷对脐静脉内皮细胞的抑制率

表2 不同培养时间对脐静脉内皮细胞的抑制

图3 香叶木苷浓度抑制率曲线

图4 香叶木苷培养时间抑制率曲线

计算得到的香叶木苷药物对脐静脉内皮细胞的抑制率如表1。从表1可看出香叶木苷对细胞的抑制作用为先降低后增高，在20μg/mL时达到最低，为负值，进一步说明此时药物对细胞的生长有促进作用。但是随着浓度的进一步增大，香叶木苷对细胞的抑制率逐渐增大，表现为细胞毒性作用。由此得出香叶木苷作用于脐静脉内皮细胞的最佳药物浓度为20μg/mL。

图3可知，香叶木苷对细胞生长有抑制作用，抑制作用先减小再增大，在48h时抑制作用最低。经软件分析，香叶木苷对脐静脉内皮细胞的生长抑制率达到50%所需的用量即IC50为254.8μg/mL。

4 讨论

图1中香叶木苷浓度为20μg/mL时的OD值达到了0.911，而本组实验的对照组即未加药的细胞OD值才为0.905，说明此时香叶木苷对脐静脉内皮细胞的生长起到促进作用，同时抑制率和抑制率曲线也验证了这个结论，IC50的值也说明香叶木苷需要很大浓度时才能使细胞的死亡率达到50%。抑制率在20μg/mL时达到了负值，也就说这个时候的作用是促进而不是抑制。

图2和图4说明了时间对香叶木苷作用于细胞的影响，即抑制作用先降低后增大，在48h时抑制作用是最低的。时间试验的抑制率先降低后增加，可能的原因是香叶木苷刚加入时对细胞有个适应的过程，此时表现为抑制，但随着加入的时间延长，细胞表现出适应状态，抑制率逐渐降低，在48h时达到最低，即达到最佳加药浓度。

从以上结论来看，香叶木苷除在动物个体上有具有增加静脉张力，改善静脉通透性，改善微循环等作用，在细胞层面上合适的浓度和一定的时间范围内对细胞的生长也有促进作用，这就为下一步研究形成静脉血栓及香叶木苷治疗静脉血栓发挥作用的相关蛋白奠定基础。

［1］马英丽，卢卫红，于晓敏，等．蓬子菜的化学成分研究［J］．中草药，2005(10):28－30．

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［6］Miguel A．C．，Manuel E．，Guiomar P．，Emilio G － Q．，et al．Simultaneous determination of diosmin and diosmetin in human plasma by ion trap liquid chromatography–atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry:Application to a clinical pharmacokinetic study．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis［J］．2010，51:875 －881．

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［9］卢卫红．中药蓬子菜药效物质基础及质量标准研究［D］．哈尔滨:黑龙江中医药大学，2004．

［10］朱惠莲，夏敏，唐志红，等．人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察［J］．中国临床康复，2004，8(27):5834－5835．