黄药子毒性组分对肝细胞内Ca2+浓度的影响

王加志，刘树民，汤青，李伟

(1．黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007;2．黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040)

黄药子临床应用时肝损害时有报道［1］，表明人们对用药安全的关注日益加深。本研究组前期研究发现，黄药子的肝损害作用与氧化应激有关［2］。本研究通过对肝细胞内Ca2+浓度的初步研究，探讨氧化应激与肝细胞内Ca2+的变化情况，为从细胞凋亡及信号转导方面研究中药肝损害奠定基础。

1 仪器与试剂

1．1 实验仪器

LSM－510－META激光共聚焦扫描显微镜(德国ZEISS公司);倒置式显微镜(Axiovert 200 MBP);BQ 50－1J恒流泵(河北保定兰格恒流泵有限公司);KDC－160HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)。

1．2 试剂

FLUO－3 AM(美国分子探针(AP)公司);胰蛋白酶(美国SIGMA公司);Ⅳ型胶原酶(美国SIGMA公司);PBS(美国SIGMA公司);DMEM培养基(美国SIGMA公司);DMSO(美国SIGMA公司);试剂均为国产分析纯。

1．3 实验动物

雄性SD大鼠4只，体质量(250±20)g，由黑龙江中医药大学药物安全评价中心(GLP)提供，动物质量合格证书号:医动字第01－10－2号。

1．4 实验药物

黄药子购于黑龙江省药材公司，产地河北，经黑龙江省药检所鉴定为薯蓣科植物黄独(Dioscorea bulbifera L．)的块茎。黄药子二萜内酯类组分制备按前期实验［3］，其在原药材中含量为 0．568%。

1．5 动物分组及给药量

SD大鼠4只，分为空白对照组、肝毒性组各2只，灌胃给药，肝毒性组给药量为0．064 8g/kg，相当于生药2．85g/kg。日两次，空白对照组为含吐温－80同等浓度的蒸馏水，共7天。

1．6 样品制备

1．6．1 细胞内Ca2+测定样品

取SD雄性大鼠4只，于末次给药12h后，断椎处死，把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消毒的剪刀剪开腹部皮肤，暴露肝脏，置于无菌灌流台中，加胶原酶50mg于灭菌的 PBS液200ml中，循环灌洗肝脏15min，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，移入无菌离心管中，加入0．25%的胰蛋白酶适量，37℃水浴中消化8～10min，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5%小牛血清的DMEM培养基，用吸管吹打混匀，即得。

1．6．2 FLUO －3 AM 工作液的配制

FLUO－3 AM 50μg溶解于40μl无水二甲基亚砜(DMSO)中即成贮备液，贮备液加入DMEM培养基

基金项目:黑龙江省中医药管理局资助课题(ZHY10－Z02)

作者简介:王加志(1977－)，男，副教授，博士，主要从事中药药性理论研究。

通讯作者:刘树民(1963－)，男，教授，博士研究生导师，主要从事中药临床药效物质基础研究及中药药性理论研究。

收稿日期:2012－06－12

修回日期:2012－07－10

10ml即得4．4μm 的工作液。

FLUO－3的共聚焦显微镜激发光峰值波长为490nm，用于检测的荧光峰值波长为525nm，扫描点面积 0．053 1mm2。

1．6．3 FLUO －3 染色方法

使用时按实际情况将工作液适当稀释，最低稀释至浓度为2μm。取细胞悬液100μl，加入10μl荧光染料，加入DMEM培养基至1 000μl，培养箱中37℃反应15min后测定，从染料加入到测定完成，不超过40min。本实验使用的浓度为2．2μm。

2 结果

细胞内Ca2+测定结果:在生理情况下，Ca2+作为细胞内第二信使，在维持细胞增殖、分裂、运动、能量代谢、氧代谢、Ca2+依赖蛋白激酶和磷脂酶的激活等方面发挥着重要作用。而这种作用的正常发挥则依赖于肝细胞内液约为0.2μmol/L的Ca2+浓度和细胞外液约1．3mmol/L的Ca2+浓度，即肝细胞始终处于胞内外1万倍浓度梯度差，悬殊的电化学梯度正是Ca2+发挥第二信使作用所必需的，也表明肝细胞内有着强有力的Ca2+稳态调节机制。内质网和线粒体是胞内最主要的钙库，因而线粒体和内质网在胞内钙稳态调节中起着主导作用。以空白对照组大鼠肝细胞内钙离子浓度为基准，评价干预因素黄药子毒性组分对肝细胞内钙离子的影响。

空白组:空白组细胞数量多，形态规整，荧光染料染色均一，亮度适中，以背景形鲜明对照，适合观察，证明以fluo－3为荧光染料负载的细胞悬液样品制备成功。

黄药子组:同等条件下制备的细胞悬液中，细胞数量最少，在相同的观察条件下，细胞的荧光亮度最强，说明细胞内游离Ca2+含量增高。结果见图1。

3 讨论

本实验使用激光扫描共聚焦显微镜技术和新一代的胞内游离Ca2+探针fluo－3/AM(典型的单波长荧光探针)，发射波长较长，荧光选择性强，自身无荧光，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解并与游离钙结合后才发出荧光，能有效地避免非特异性染色，不需要紫外光激发，避免了紫外光对活细胞样品的损伤，不需要制作工作曲线。

Ca2+作为主要的细胞内信使，同时也是内质网－线粒体交流的主要“语言”，与凋亡密切相关。细胞质内钙离子浓度的升高会导致钙离子转移到线粒体［4－5］，引起线粒体 Δψm 下降，损伤线粒体，诱导细胞凋亡。线粒体膜的损伤又可导致Ca2+进一步升高，形成恶性循环，加重细胞的损害。

图1 钙离子激光共聚焦扫描图

黄药子可损伤肝细胞线粒体，并生成大量的氧自由基［3］，线粒体损伤后，肝细胞ATP缺乏，胞膜受损，跨膜Ca2+内流增加，内质网等胞内钙库释放Ca2+增多，胞膜Ca2+泵排Ca2+能力和内质网膜Ca2+－Mg2+－ATP酶摄Ca2+能力减弱，结果导致胞浆内钙超载，线粒体保护性摄取胞浆内游离Ca2+以平衡钙稳态，最终会导致自身钙超载，故肝细胞钙超载必然伴随线粒体钙超载。

［1］李维昌，杨军，李惠文，等 黄药子致药物性肝病1例［J］．临床合理用药，2009，2(15):79．

［2］李伟，赵艳，汤青，等．黄药子醇提物肝脏毒性部位筛选研究［J］．中医药信息，2009，26(1):28 －29．

［3］王加志．黄药子中二萜内酯类成分对大鼠肝细胞损伤作用的实验研究［J］．药物不良反应杂志，2009，11(1):13 －16．

［4］洪莉，蔡威．凋亡与肝细胞损伤机制的研究进展［J］．临床小儿外科杂志，2006，5(1):42 －46．

［5］Kim JH，Choi S，Jung JE，et al．Capacitative Ca2+entry is inv － olved in regulating soluble amyloid precursor protein(sAPPα)release me-diated by muscarinic acetylcholine receptor activation in neuroblastoma SH － SY5Y cells［J］．J Neurochem，2006，97(1):245－254．