HIF-1α与SDF-1α/CXCR4在星形胶质细胞缺氧应激过程中的调控机制与作用

黄生炫， 安 宇， 李 静， 熊云彪， 许长平， 杨 恒， 杨承勇， 谭新杰， 刘窗溪

脑梗死为一临床常见的疾病类型，目前治疗方法主要有溶栓、神经保护、康复等，但均未能从根本上解决因梗死后导致的神经细胞死亡。为此，国内外大量的学者对脑梗死后以干细胞为基础的细胞修复治疗展开了系列研究，谭新杰等人［1］在研究成年大鼠大脑中动脉栓塞缺血再灌注时发现缺氧应激可激活神经元前体细胞的发生，并诱导神经元前体细胞朝着梗死区域迁移，但细胞在缺血灶中的迁移机制尚未明确。

了解中枢神经系统中细胞在缺氧应激过程中的迁移机制有利控制其中的调控环节，增加其迁移效率，进而促进梗死区域的神经细胞修复。本文以中枢神经系统中常见的星形胶质细胞为研究对象，模拟脑梗死时的缺氧环境，探讨在缺氧应激过程中HIF-1α与SDF-1α/CXCR4的调控关系，以期为脑梗死的干细胞治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1．1 实验材料与试剂 出生24h内的SD乳鼠由贵阳医学院动物中心提供，DMEM/F12购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季清公司，CoCl2购自Sigma公司，GFAP抗体购自北京博奥森公司，倒置相差显微镜及荧光显微镜为Olympus公司产品，siRNA由本研究组和大连宝生物公司共同设计合成，逆转录试剂盒购自Fermentas公司，ELISA试剂盒购自美国USCN公司，其余试剂均为国产分析纯。

1．2 星形胶质细胞的分离培养及鉴定 使用酶消化及机械吹打法培养SD乳鼠星形胶质细胞。免疫组织化学方法对星形胶质细胞进行鉴定。

1．3 HIF-1α沉默表达载体构建 由本研究组和大连宝生物公司根据NCBI大鼠HIF-1α基因序列设计合成siRNA片段及其阴性对照片段。大鼠HIF-1α基因的siRNA序列为CCAGTTACGATTGTGAAGT。其阴性对照序列为GCCTTATACGCGATTAAGA。

1．4 实验分组

1．4．1 未沉默缺氧组 培养星形胶质细胞至80% ～90%融合，以终浓度分别为 0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L 的 CoCl2处理细胞，分别在0h、4h、16h、24h、36h 提取总RNA，留存培养基上清于－20℃冰箱备用。

1．4．2 沉默阳性缺氧组 培养星形胶质细胞至80% ～90%融合，用脂质体2000转染siHIF-1α质粒48h后，以终浓度为 50μmol/L CoCl2处理细胞，分别在0h、4h、16h、24h、36h 提取总RNA，留存培养基上清于－20℃冰箱备用。

1．4．3 沉默阴性缺氧组 培养星形胶质细胞至80%～90%融合，用脂质体2000转染阴性空质粒48h后，以终浓度为50μmol/L CoCl2处理细胞，分别在0h、4h、16h、24h、36h 提取总 RNA，留存培养基上清于－20℃冰箱备用。以上实验均独立重复3次。

1．5 RT-PCR 检测 HIF-1α、SDF-1αmRNA 表达根据SD大鼠GeneBank，各目的基因PCR引物序列由上海生工合成。HIF-1α引物序列:上游引物:5’-TGCTCATCAGTTGCCACTTC-3’;下游引物:5’-CATGGTCACATGGATGGGTA-3’，扩 增 长 度 为310bp。SDF-1α引物序列:上游引物:5’-CAGCCGTGCAACAATCTGAAG-3’;下游引物:5’-CTGCATCAGTGACGGTAAACC-3’，扩增长度为124bp。β-actin引物序列:上游引物:5’-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3’;下游引物:5’-ACCCAGGAAGGAAGGCT-3’，扩增长度:194bp。提取总RNA并检测其纯度浓度及完整性。经逆转录反应、半定量分析上述基因mRNA表达。各取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，运用Alpha Imager型图像分析系统观察电泳结果，分别测出HIF-1α、SDF-1α扩增带的光密度值(OD值)，并以β-actin扩增带的光密度值作为参照，得出HIF-1α、SDF-1α与β-actin光密度值的相对比值。

1．6 ELISA检测 各实验组星形胶质细胞培养基上清SDF-1α含量，按试剂盒说明书操作。

1．7 统计学方法 采用SPSS 18．0统计软件数据统计多组间均数比较采用方差分析、两组间比较采用t检验，P＜0．05为显著性差异。

2 结果

2．1 星形胶质细胞原代培养与鉴定 原代细胞成分复杂，随着传代次数增加，异种细胞逐渐被淘汰，于第3代可获得形态均一的纯化星形胶质细胞，细胞呈长梭形，漩涡状排列(见图1);GFAP免疫荧光及DAB染色符合星形胶质细胞特征(见图2、3)。

2．2 星形胶质细胞未沉默缺氧组 HIF-1α、SDF-1α mRNA表达水平及SDF-1α蛋白分泌水平经预实验后发现，不同浓度CoCl2、不同处理时间刺激的星形胶质细胞，其HIF-1α和SDF-1α mRNA表达上调，且与CoCl2浓度及处理时间密切相关(其中50μmol/L的CoCl2处理其变化趋势明显，以下结果用该组数据说明)。以终浓度50μmol/LCoCl2处理0h、4h、16h、24h、36h 后检测 HIF-1α 和 SDF-1α mRNA表达。CoCl2处理星形胶质细胞后 HIF-1α和SDF-1α mRNA 表达上调(P＜0．05)(见图4、5)。ELISA检测细胞培养基中的SDF-1α蛋白表达量上调(P＜0．05)(见图6)。

2．3 建立沉默HIF-1α基因表达的星形胶质细胞模型 用脂质体2000将siHIF-1α阳性沉默质粒及阴性对照空质粒转染星形胶质细胞48h后检测HIF-1α mRNA表达。结果显示阳性沉默组HIF-1α mRNA较阴性沉默组表达明显降低(P＜0．05)(见图7、8)，说明星形胶质细胞HIF-1α阳性沉默模型中HIF-1α基因表达受到沉默抑制。

2．4 星形胶质细胞沉默阳性缺氧组中 HIF-1α、SDF-1α mRNA表达水平及SDF-1α蛋白分泌水平 用脂质体2000将siHIF-1α阳性沉默质粒转染星形胶质细胞48h后，以终浓度50μmol/LCoCl2处理0h、4h、16h、24h、36h 后检测 HIF-1α、SDF-1α mRNA表达。结果显示HIF-1α、SDF-1α mRNA变化不明显(P＞0．05)(见图9、10)。ELISA检测细胞培养基上清中 SDF-1α蛋白表达量无明显变化(P＞0．05)(见图11)。

2．5 星形胶质细胞沉默阴性缺氧组中HIF-1α、SDF-1α mRNA表达水平及SDF-1α蛋白分泌水平采用脂质体2000将阴性对照空质粒转染星形胶质细胞48h 后，以终浓度50μmol/L CoCl2处理0h、4h、16h、24h、36h后检测 HIF-1α、SDF-1α mRNA 表达。结果显示 HIF-1α、SDF-1α mRNA 表达上调(P＜0．05)(见图12、13)。ELISA检测细胞培养基上清中的SDF-1α蛋白表达量上调(P＜0．05)(见图14)。

3 讨论

缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是体内维持氧稳态的重要转录因子，它通过结合低氧反应基因的低氧反应元件(hypoxia response element，HRE)，参与调控缺氧诱导的一系列基因的表达，使机体更好地适应低氧环境［2，3］。与HIF-1不一样，SDF-1是趋化因子CXC亚家族的一个成员。它广泛地表达于多种细胞和组织中，并大量及选择性地在发育的中枢神经系统中表达。能与其唯一受体CXCR4相互特异性结合构成一个与细胞间信息传递、细胞迁移密切相关的偶联分子对［4］。在关于 HIF-1与 SDF-1、CXCR4关系的研究中，Schioppa T等［5］发现缺氧能通过HIF-1α的激活而上调人类单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和肿瘤细胞上CXCR4的表达，并提出缺氧-HIF-1α-CXCR4通路可能是调控缺氧条件下不同类细胞迁移的机制。Ceradini DJ等［6］在研究低氧环境中的局部损伤组织时发现，低氧可激活对缺氧敏感的转录因子HIF-1，调控SDF-1表达使其增多，并形成适合干细胞存在及生长的微环境，通过SDF-1促进CXCR4阳性的干细胞黏附、迁移和归巢到缺氧部位，参与血管形成，这说明SDF-1基因启动子区内含有低氧反应元件，HIF-1与HRE结合而激活SDF-1的表达。李梅等［7］在研究低氧对大鼠肺动脉内皮细胞HIF-1α及SDF-1表达影响时，证实HIF-1与SDF-1存在信号调节关系，在介导祖细胞迁移和黏附至肺动脉内皮细胞的过程中起重要作用。在中枢神经组织中是否也存在缺氧-HIF-1-SDF-1/CXCR4通路，本文就此展开初步研究。

我们利用CoCl2中Co2+可以取代氧感受器血红蛋白卟啉环中的Fe2+，Co2+对氧的亲和力较低，使血红蛋白不能与氧结合，从而诱导促红细胞生成素及其他对低氧敏感基因表达增加，这样就模拟了细胞的缺氧状态［8］。本研究采用 50μmol/L CoCl2刺激星形胶质细胞模拟缺氧，在处理4h后，细胞中HIF-1α及SDF-1α mRNA表达开始上升并达到峰值，随着时间推移，HIF-1α及SDF-1αmRNA表达下降呈下降趋势。该结果从转录水平说明星形胶质细胞缺氧应激过程中HIF-1α mRNA表达增加，可以推测此时HIF-1α与HRE结合而激活SDF-1α的表达。SDF-1基因启动子区内含有低氧反应元件［7］。在检测相应标本缺氧后不同时间点培养基上清中的SDF-1α蛋白时，我们发现缺氧16h后SDF-1α蛋白表达达一峰值，而后下降，至缺氧24h后SDF-1α蛋白表达又呈上升趋势，并超过前一峰值。说明在SDF-1 mRNA表达上调后，其转录产物也上调。但在缺氧24h后SDF-1α蛋白表达又呈上升趋势，可能与CoCl2再次刺激HIF-1基因表达上调有关。为进一步说明SDF-1基因启动子区内含有低氧反应元件，我们根据HIF-1基因序列设计相应的小干扰RNA(siHIF-1α)，诱导 HIF-1基因沉默，在转染48h后用50μmol/L CoCl2处理星形胶质细胞，分别在不同时间点检测 HIF-1α、SDF-1α mRNA，结果显示HIF-1α、SDF-1α mRNA变化不明显，检测培养基上清中SDF-1α中的含量，发现SDF-1α含量维持在较低水平，缺氧的刺激未能引起SDF-1含量的变化。这说明脂质体2000将siHIF-1α阳性沉默质粒转染星形胶质细胞后，细胞内质粒启动子转录出的siRNA降解了HIF-1α mRNA，引起HIF-1基因表达沉默，此时无HIF-1与HRE结合而充分激活SDF-1 mRNA的表达，其对应的转录产物也相应下调，以至培养液中的SDF-1α含量无明显改变。也说明该脂质体载体能够有效地将HIF-1α特异性 siRNA导入星形胶质细胞，实现HIF-1α的沉默。而在转染48h用CoCl2处理24h后培养液中的SDF-1含量稍有升高，可能与HIF-1α的mRNA未完全沉默、再次受到缺氧刺激有关。用脂质体2000将阴性对照空质粒转染星形胶质细胞后，因空载体未插入特异性沉默HIF-1α的目的片断，细胞内质粒启动子转录产物不能降解HIF-1α mRNA，HIF-1α mRNA表达不受影响。以上实验可以明确SDF-1基因启动子区内含有HRE。缺氧刺激时，细胞HIF-1α mRNA表达上调，HIF-1与HRE结合而激活SDF-1α mRNA表达上调，其蛋白表达产物SDF-1α表达增加。说明缺氧-HIF-1-SDF-1/CXCR4通路在中枢神经系统中确实存在。

在中枢神经系统中明确该通路，有利于进一步使用神经干细胞治疗脑梗死，如将CXCR4基因转染到神经干细胞中，可能使后者对梗死部位分泌的SDF-1α的趋化能力明显增强，达到修复梗死区域的目的。再比如将HIF-1注射到梗死部位，有利于神经干细胞迁移到修复梗死区域。尽管缺氧诱导因子HIF-1α与SDF-1α/CXCR4通路在中枢神经系统缺氧中存在调控关系。但是还有很多问题不明确，例如SDF-1α/CXCR4通路是否能直接介导神经干细胞的迁移;HIF-1α是否通过SDF-1α/CXCR4通路调控神经干细胞的迁移;若是SDF-1α/CXCR4通路能直接介导神经干细胞的迁移，其具体机制尚需进一步研究。总之，对中枢神经系统中细胞迁移机制的进一步研究，将有利于对脑梗死后以干细胞为基础的细胞修复治疗。

图1～3 星形胶质细胞原代培养与鉴定结果

图4～6 星形胶质细胞未沉默缺氧组HIF-1α、SDF-α mRNA表达水平及SDF-α蛋白分泌水平

图7～8 HIF-1α阳性沉默质粒及阴性对照组空质粒转染星形胶质细胞48h后情况

图9～11 星形胶质细胞沉默阳性缺氧组中HIF-1α阳性沉默质粒及阴性对照组空质粒转染星形胶质细胞48h后情况图12～14 星形胶质细胞沉默阴性缺氧组中HIF-1α阳性沉默质粒及阴性对照组空质粒转染星形胶质细胞48h后情况

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