鸡甲胺磷中毒性神经肌病模型的建立及电生理研究

胡轶虹， 金梅香， 郭尔平， 江新梅

近年来人们关注急性有机磷中毒后引起迟发性周围神经病(organophosphate induced delayed neuropathy，OPIDN)的研究，本病多发生于急性中毒后20d左右，主要表现为感觉-运动性多发性神经病，其特点为运动重于感觉，远端重于近端，下肢重于上肢，发生率5%左右［1］。有学者试图以伴或不伴有感觉障碍将其分为“迟发性神经炎”和“中毒性肌病”［2］，本文中仍延用“迟发性神经病”。本病的发生与有机磷农药的种类、中毒途径及中毒量有关。本研究用甲胺磷使leghorn鸡染毒，将在出现迟发性神经病临床表现前进行神经电生理检测，并通过动态观察电生理变化评估预后。

1 材料与方法

1．1 动物来源及分组 莱亨母鸡50只，鸡龄8～14 个月，体重1．5 ±0．5kg，营养良好，购自长春市生物制品所免疫室。随机分为5组(n=10)，以同样方式染毒，分别于第 1、2、3、4、8 周取材。

1．2 主要试剂 硫酸阿托品注射液购自河北省郑州兽药厂，50%甲胺磷乳油购自湖北沙隆达股份有限公司。实验用台式液(试剂购自北京化工厂):氯化钠 8．0g，氯化钾 0．2g，氯化钙0．2g，碳酸氢钠 1．0g，磷酸二氢钠 0．05g，氯化镁 0．1g，葡萄糖1．0 g，蒸馏水加至 1000ml。

1．3 动物模型的建立 这些Leghorn鸡实验前称重，单只饲养于底是铁丝网眼的铁丝笼(0．5×0．5×0．8m)之中，房间的温度控制在21℃ ～23℃，每12h光照/12h黑暗为一个循环，甲胺磷用植物油溶解，浓度为5mg/ml，按2ml/kg体积通过套管直接灌入已断食24h的鸡素囊中，染毒的鸡用阿托品保持度过急性期。

1．4 标本的留取 分别于染毒后1、2、3、4、8w留取标本。鸡在腹腔注射水合氯醛麻醉下，固定在特制木板上，室温25℃，下肢去皮，在髂关节处沿坐骨神经走行钝性剥离肌肉，用玻璃分针游离坐骨神经，至膝关节分为胫神经和腓神经，于髂关节及膝关节两处用小剪刀剪断，取坐骨神经长约3cm浸于台式液中，除去周围脂肪组织，进行电生理检测。

1．5 主要仪器及电生理学检测方法 连接Powerlab生物信号记录仪(澳大利亚艾德公司生产，吉林大学生理实验室提供)各组件，打开电源开关，予热20～30min。将神经屏蔽盒的所有电极用台氏液棉球擦拭，然后用一台氏液浸湿的棉线调试记录仪。其后将神经粗的一端放在刺激电极上，细的一端放在记录电极上。盖上屏蔽盒，在50Hz交流干扰小的情况下进行实验。调节刺激强度，从0．1v开始，逐渐增加刺激强度至产生双向动作电位，当刺激强度增至1v，动作电位不再加大，记录刺激伪迹前沿到动作电位起始处时间间隔即为潜伏期，动作电位的上相波顶点与下相波的最低点之间的距离即为波幅。运动神经传导速度的测定基本同前，近端置于刺激电极上，远端置于两个记录电极上，两记录电极间距离为2．5cm，放大器有A、B两组，示波器Y上和Y下条件一致(放大倍数均为500)，按刺激器起动钮可产生上下两个动作电位，用两记录电极间距离除以两动作电位潜伏期差即为神经传导速度。

1．6 临床观察 每日观察迟发性神经毒性的临床体征，临床OPIDN的分级标准依照1987年Robertson的分级标准［3］，0级:没有体征;1级:步态异常;2级:动物用后臀休息后但还能站立;3级:完全瘫痪。

2 结果

2．1 模型死亡、体征变化 鸡经甲胺磷染毒后5～10min即表现萎靡、流涎、瞳孔缩小、喜卧，从第2天开始有动物死亡，共死亡6只，死亡时间为2～6d，实验组平均死亡率为12%。之后经过1w左右的潜伏期，出现周围神经病的症状，动物的表现开始呈全身无力状态，喜卧，后出现步态不稳，逐渐发展为站立困难，此期肌力下降表现为1级及2级，无完全瘫痪者，至4w完全恢复正常，总发病率为15．9%。

2．2 电生理检测结果 染毒后1w，波幅有明显降低，而运动神经传导速度无明显改变，提示周围神经早期以轴索损害为主。其后2、3w波幅逐渐升高，至第4周波幅已近恢复正常。染毒后2w出现潜伏期延长，运动神经传导速度减慢，提示出现脱髓鞘改变，至第8周运动神经传导速度已恢复正常。电生理检测阳性率为90%(见表1)。

表1 坐骨神经电生理动态变化表(±s)

表1 坐骨神经电生理动态变化表(±s)

波幅1、2、3 与4、8w 间有显著性差异 P ＜0．05;远端潜伏期1、8w 与2、3、4w 间有显著性差异 P ＜0．05;运动神经传导速度 1、8w 与 2、3、4w间有显著性差异P＜0．05

1w 2w 3w 4w 8w波幅(mV)远端潜伏期(ms)运动神经传导速度(m/s)5．98 ±0．71 0．99 ±0．08 28．21 ±2．70 4．87 ±1．83 1．25 ±0．09 21．56 ±1．48 10．60 ±1．14 1．24 ±0．23 21．52 ±3．73 12．06 ±0．46 1．26 ±0．09 20．76 ±1．70 11．75 ±1．17 1．08 ±0．11 24．83 ±2．50

3 讨论

甲胺磷(又名多灭磷或克螨隆:Methamidophos/Tamaron，化学名 O，S-二甲基-硫代磷酰胺:OS-dimethylphosphoramidothiolate)属硫代磷酸酯类化合物，高毒，是一种高效、内吸、触杀、低残留、广谱性有机磷杀虫剂，对人、畜高毒［4］。不同途径包括消化道、呼吸道和皮肤接触均可造成急性中毒，但以消化道中毒所致迟发性神经病的机率最大。不同的有机磷农药引起的OPIDN有种属特异性，以人类和鸡最为敏感，而啮齿动物则不敏感［5］。鉴于消化道染毒毒物剂量易于控制，鸡对甲胺磷的敏感性高，我们本次实验选用莱亨母鸡进行甲胺磷染毒制成迟发性神经病的动物模型。莱亨母鸡在染毒后1w出现周围神经电生理改变(阳性率90%)，2w出现不同程度的步态异常(总发病率15．9%)，说明我们成功的构建了迟发性神经病的动物模型。

1987年Senanayake首次报道急性有机磷中毒后1～4d可发生一种以肌无力为突出表现的综合征，因发病时间居于急性胆碱能危象和迟发性周围神经病之间被称为中间综合征［6］，为有机磷中毒的主要病死原因。本实验动物染毒后已用阿托品抢救度过急性期，死亡时间主要在2～6d的主要原因可能是中间综合征。

聂淑敏等［7］提出中毒引起的周围神经变性，先影响最长神经的末稍端，而后慢慢地向中枢段扩布。王海凤对28例患者临床及神经肌电分析后，认为有机磷杀虫药中毒后迟发性神经病是一种以轴索病变为主的周围运动神经病［8］。本实验电生理检测显示染毒后1w出现波幅明显降低，2w出现运动神经传导速度减慢，但比波幅改变轻，这与上述临床分析完全吻合。中毒性变性的原发病变可能主要在胞体，是代谢性障碍，导致轴浆流中营养成分减少，供应末梢减少，很少有脱髓鞘变化。因此中毒变性时，主要表现为动作电位波幅剧减，而运动神经传导速度大多正常或轻度减慢。

赵宁军等［9］对26例有机磷农药中毒致迟发性神经病患者进行电生理检测，有5例出现早期电生理改变，明显早于临床体征的出现。本实验也发现了与临床相似的结果，即电生理改变(染毒后1w)明显早于临床体征(染毒后2w)的出现，电生理检测的阳性率(90%)也明显高于临床体征的阳性率(15．9%)，而临床体征的恢复(4w)也明显早于电生理改变的恢复(8w)。因此，对有机磷杀虫药中毒的患者急性中毒症状消失后，还应密切观察，及时了解有无迟发性周围神经损害。神经电生理检测可早期协助本病的诊断，应定期检查，同时对神经修复的预后判定不能单纯依靠临床体征，应结合电生理检查综合判定。

目前该病发病机制尚不明确，因此尚无特异的治疗方法。李芳健等［10］对132例急性有机磷中毒者临床结局2年后随访调查研究发现，中毒后1年内OPIDP发生率为9．17%，其中仅5例赴医院医治，1例6个月后完全恢复，其余未经医院治疗也有不同程度好转。本实验在莱亨母鸡染毒后，只应用阿托品渡过急性期，未应用其他药物干预治疗，临床体征(4w)及电生理检测(8w)均有不同程度的好转，提示本病有自愈倾向。

［1］王汉斌，阮金秀．急性有机磷农药中毒致脏器损害与并发症的防治［J］．中华急诊医学杂志，2001，10:285 －287．

［2］吴祖舜，王小冬，程宝庚，等．实验性甲胺磷中毒的肌肉与神经病理研究［J］．临床神经病学杂志，1992，5:73 －75．

［3］Robertson DG，Schwab BW，Sills RD，et al．Electrophysiologic changes following treatment with organophosphorus-induced delayed neuropathy-producing agents in the adult hen［J］．Toxicol Appl Pharmacol，1987，87:420 －429．

［4］范永仙，陈小龙，姜晓平，等．甲胺磷农药的生物降解研究进展［J］．微生物学杂志，2002，22:45 －47．

［5］郭 斌，郭丽华，郭洪志，等．有机磷中毒引起的迟发性神经病的临床与电生理研究［J］．中风与神经疾病杂志，1997，14:186－187．

［6］Sennanyak N，Karakkiedde L．Neurotoxic effects of organophosphorus insecticides:an intermediate syndrome［J］．New Engl J Med，1987，316:761－763．

［7］聂淑敏，刘向军，解玉梅，等．有机磷中毒并发周围神经损害电生理分析［J］．实用医技杂志，2004，11:2205．

［8］王海凤．有机磷中毒后迟发性神经病28例的临床与神经肌电图分析［J］．临床脑电学杂志，2000，9:232－233．

［9］赵宁军，燕宪亮，卓晓英，等．26例有机磷农药中毒致迟发性神经病的临床表现和神经电生理分析［J］．中国急救医学，2010，30:1030－1032．

［10］李芳健，何凤生，崔树伟，等．急性有机磷中毒者临床结局2年后的随访调查［J］．中国公共卫生，2004，20:731 －733．