兽药有关物质研究中的常见问题

刘艳华，杨大伟，郭桂芳，梁先明，段文龙

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

兽药中的杂质按理化性质一般分为三类:有机杂质、无机杂质和残留溶剂。有机杂质包括工艺中引入的杂质和降解产物，来源于生产工艺和/或贮存期间的降解，这类杂质的化学结构与活性成分的分子式类似或具渊源关系，故通常又称之为有关物质［1］。有关物质的研究是兽药研究的重要环节，贯穿于整个兽药研究的始终。其是否能被全面准确地控制，直接关系到兽药的质量与安全性，虽有相关技术指导原则参考［1－4］，但限于我国兽药研发水平和生产的现状，有关物质研究仍然是兽药研发的薄弱环节，本文主要针对兽药有关物质研究中常见的问题进行分析，以资借鉴。

1 分析方法的选择

分析方法的选择直接关系到有关物质测定结果的专属性与准确性，因此，有关物质研究的首要问题是根据主药及有关物质的理化性质、化学结构、有关物质的控制要求等确定适宜的检查方法，有效检出兽药中的有关物质。

常用的检查方法主要是薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)。TLC通常对有关物质进行定性或半定量研究，可以用于没有紫外吸收的有关物质;HPLC可对有关物质进行定性或定量研究，适用于多种有关物质，是目前普遍采用的方法;气相色谱法主要用于检查挥发性有关物质。各种分析方法侧重点不同，应用时采用不同原理的分析方法进行相互补充与验证。

常见问题:(1)忽视检查方法的比较、优选研究。目前的新兽药注册严格意义上说均为仿制药，检查方法应与已上市产品质量标准或者文献报道的方法做对比研究。如采用HPLC方法进行盐酸头孢噻呋注射液的有关物质检查，国外同品种兽药采用梯度洗脱，最大杂质峰δ－2－反式肟，限量为3.0%，4－酮基头孢噻呋、MW=537的未知物、δ－3－顺式肟和其他杂质的总限度为3.5%;国内企业申报时采用等度洗脱，仅规定杂质总限量为不得大于3.0%;未对单个杂质进行定性研究。梯度洗脱确实存在基线漂移大、操作相对繁琐的缺点，但其在较短时间内检查杂质的极性范围广，并可改善峰形，提高灵敏度，比较适用于对多种极性不明的未知有关物质进行检测，因此企业申报时在无充分研究的基础上直接采用等度洗脱，且不进行对比研究，可能会导致有关物质的漏检。(2)完全照搬国外同品种标准，未根据自身产品的特点进行针对性研究。如原料中有关物质的产生与合成工艺密切相关，盐酸沃尼妙林原料中有关物质直接参照《欧洲药典》6.0版进行检查，未考察国内外合成工艺不同可能导致的产品有关物质不同;且不同仪器及色谱条件的波动，使杂质的校正因子产生一定范围的误差［5］，但企业申报时未提交自研产品杂质谱分析研究的相关资料，也未对相对响应因子进行相关验证，无法对方法适用性进行判断。

2 分析方法的验证

有关物质的方法验证重点在于专属性和灵敏度的验证。专属性系指在其他成分可能存在的条件下，采用的方法能正确测定出被测有关物质的特性。检测限是反映分析方法灵敏度的一个重要指标，要符合质量标准中对有关物质限度的要求，检测限不得大于该有关物质的报告限度。

方法验证时要结合兽药的化学结构特点、制剂的处方工艺和降解途径等进行研究，分析兽药中潜在的有关物质，具体方法有:(1)有关物质可以获得，如为已知的某中间体、副产物或降解产物，可在原料或制剂中加入一定量进行系统适用性研究，考察各有关物质与主峰间的分离度是否符合要求，从而验证分析方法对有关物质的分离能力。(2)有关物质不可以获得，需要与已验证或兽药典收载的方法进行对比或破坏性试验。破坏性试验多采用酸、碱、光、热、氧化反应等强制降解来验证，在试验过程中，应注意适度破坏，一般以破坏后主成分的含量占绝大部分为宜(80% ～90%)，要达到这种破坏程度，需要在研究过程中进行摸索，先通过初步试验了解样品对光、热、酸、碱和氧化等的基本稳定情况，然后再调整光照强度、酸碱浓度、破坏时间、温度等试验条件，常见的试验条件为强光照射:4500 lx;高温:较加速试验温度高10℃;酸水解:0.1～1 mol/L盐酸或硫酸溶液;碱水解:0.1～1 mol/L氢氧化钠溶液;氧化:3% ～5%过氧化氢溶液。注意并不是每种破坏条件下主药必须降解，具体条件要结合兽药的特点。

常见问题:(1)破坏程度不当。如非泼罗尼原料药在酸、碱、氧化、光照、高温等条件下进行破坏试验，主药含量分别为 99.08%、96.45%、99.44%、98.53%和99.43%，其新增有关物质含量小，破坏程度不足，不能很好考察检测方法的分离能力。如果破坏性条件过于剧烈，会产生一些在生产和贮存条件下不可能生成的二级甚至三级降解产物，对色谱条件的筛选不利。(2)未进行检测波长的选择，这是兽药有关物质研究中最常见的问题。优化的检测波长应是主要有关物质的最大吸收，而不是主药的最大吸收，同时，应使主药和各主要有关物质的响应差异最小，多采用二极管阵列检测器(DAD)进行波长的选择。(3)未考察主药和有关物质的物料平衡，即在主药含量下降的同时，有关物质增加了相应的失去量。如托芬那酸注射液稳定性试验中主药含量下降约5%，但有关物质均未检出，在其提供的破坏性试验资料中仅考察主峰与相邻有关物质峰的分离度，未对检测波长选择，未考察主峰与有关物质的物料平衡，也未考察空白辅料在破坏性试验条件下的影响，因此造成方法的不可行。(4)未提供方法的灵敏度或仅文字叙述而无任何数据和图谱来进行证明。有的企业虽然提供了图谱，但纵坐标过大，导致实际看到的为一水平直线，无从判断检测限是否符合信噪比大于3的要求，试验结果的可信度不高。(5)未进行系统适用性试验。HPLC色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。国外企业的内控标准大多制订指标的限度，在有关物质不可获得时，甚至通过破坏性试验条件下的样品来进行系统适用性试验，国内企业在研究时多未进行相应规定，因此会出现色谱图中明显的主峰拖尾仍进行试验，分辨不出是样品超载，还是主峰包含有关物质峰造成的，分析方法不可信，结果不可靠。

3 定量方法的选择

目前有关物质的检查多采用HPLC法，定量方法有:(1)有关物质对照品法;(2)加校正因子的主成分自身对照法;(3)不加校正因子的主成分自身对照法;(4)峰面积归一化法。方法1定量比较准确、定位方便，缺点是费用高、购买不到有关物质对照品时需要提供对照品的制备和考核材料，是有条件时首选的方法。方法2需对校正因子进行严格的测定，仅适用于已知有关物质的控制，定量比较准确，但定位较困难，需测定校正因子，适用于有关物质和主成分响应因子差异大(有关物质对主成分的相对响应因子在0.9～1.1范围内时可忽略校正因子)且对照品昂贵时首选的方法。方法3的前提是假定有关物质与主成分的响应因子相同，适用于与主成分具有相同或类似发色基团的有关物质，其费用低、不需定位，但定量准确度较差，是有关物质对照品时首选的方法。方法4简便快捷，但存在各有关物质响应因子不一定相同、有关物质量与主药量不一定在同一线性范围内、仪器对微量有关物质和常量主药的积分精度及准确度不相同等因素，虽然费用低、不需定位，但定量准确性较差、影响因素多、结果重复性差，一般不提倡使用。

常见问题:(1)未提供采用峰面积归一化法的理由。虽有文献报道［6］随着现代液相色谱仪性能的提高，仪器的线性范围一般可达3个数量级以上，实际检测时一般不会超出线性范围，因此归一化法和不加校正因子的主成分自身对照法所得结果往往基本一致。但兽药企业在申报时并未考虑有关物质和主药的含量是否在仪器的线性范围内，并且采用面积归一化法时，为防止主药峰面积太大，进样量少，有关物质峰可能较小，其峰面积测定值的相对误差就会较大，理论上讲可能造成面积归一化法误差偏大，因此该方法不推荐用于微量有关物质的检查。(2)未提供定量时的积分参数，起草说明、标准中也未提供最小峰面积的阈值。《英国药典》(2011年版)对有关物质规定有报告限度或最小峰面积阈值，《中国兽药典》(2010年版)和《中国药典》(2010年版)目前对此无强制要求，仅部分品种对此有规定，但实际检测时，最小峰面积设定的大小，直接会影响到有关物质含量的测定值，其参数设定得越大，有关物质峰越不容易被积分出来，有关物质含量相对容易合格，对有关物质含量处于边缘时，容易产生检验结论的分歧，因此建议企业在标准中对此进行规定，避免申报材料中出现明明有峰却不进行积分的现象。

4 限度的制订

有关物质限度的确定首先考虑安全性，尤其是有药理作用或毒性的有关物质;其次考虑生产的可行性及批与批之间的正常波动;还要考虑兽药本身的稳定性。

对于创新兽药，可直接用分离纯化的有关物质进行安全性研究，也可采用含有一定种类与数量有关物质的样品进行一系列药理毒理及临床研究来验证兽药的安全有效性。如果在这些研究中并未明显反映与有关物质有关的毒副作用，即使有关物质的含量超出指导原则［1］的报告限度，从安全性方面考虑，也可认为该有关物质的含量已经过了安全性的验证。如有关物质是该药物在动物中的主要代谢产物，则对该有关物质可不考虑其安全性，但需制订合理的限度。

对于已有国家标准的兽药，可以根据已有的标准制订相应的有关物质限度。如果该标准中未规定有关物质的限度，应与已上市同品种兽药进行全面的质量对比研究，根据质量对比研究的结果，以及稳定性考察的结果，决定是否在质量标准中对有关物质进行控制并制定相应的限度。由于工艺或处方的不同导致在研产品与已上市同品种产品的有关物质种类不同，若限度超过规定的合理限度，为了保证产品的安全性，应考虑优化产品的处方与制备工艺，将有关物质的含量降到规定的限度以内。如仍达不到要求，则应做必要的安全性研究。

常见问题:(1)药理毒理和临床研究用样品中有关物质含量过低。一般而言，按照毒理研究样品、临床研究样品和上市产品的顺序，其中的有关物质含量应依次递减，毒理研究用样品中的有关物质含量应该最高［7］。在毒性试验可接受的前提下，只要临床使用兽药中有关物质的含量小于毒性试验中有关物质的含量，就可认为有关物质的安全性已经通过评价。目前企业提交资料中往往是药理毒理研究样品和临床研究样品相同，稳定性考察试验样品中有关物质含量较药理毒理试验样品中有关物质含量低，如米尔贝肟原料药药理毒理所用样品的含量均≥98%，但该原料药在长期稳定性考察时1个批次0个月的有关物质检测数据为2.20%，所制订有关物质限度为3.0%，其安全性风险就得不到有效的控制。(2)对超过有关物质相应限度的样品未按相关指导原则进行研究。如规定兽医专用制剂中杂质鉴定限度为1.0%，那么高于此限度的杂质就应进行定性分析，确定其化学结构。但从申报资料的提交上看，目前多数企业未进行此类研究，因此企业在研发兽药时，务必熟悉指导原则的有关规定，在研究的完整性和规范性上符合要求。

随着对有关物质认识的深入、检测手段的发展，对有关物质的技术要求也在不断提高，企业应重视兽药研发中的有关物质研究，通过系统全面的研究，在不影响兽药疗效、不发生与有关物质相关的毒副反应的前提下，将有关物质控制在一个安全、合理的范围内，以切实保证兽药的质量和安全。

［1］农业部公告第630号.兽用化学药物杂质研究技术指导原则［S］.

［2］中国兽药典委员会.兽药杂质分析指导原则［S］.中华人民共和国兽药典附录二〇一〇年版.

［3］VICH GL10:Impurities in new veterinary drug substances［EB/OL］.(2008 － 01)http://www.www.vichsec.org/pdf/2000/GL10_ST7(R).pdf

［4］VICH GL11:Impurities in new veterinary medicinal products［EB/OL］.(2008 － 01)http://www.www.vichsec.org/pdf/2000/GL11_ST7(R).pdf

［5］张哲峰.HPLC法检测有关物质中校正因子研究与使用中的几点考虑［J/OL］.药品技术审评论坛，2011(4).(2011－12 － 07)http://www.cde.org.cn/dzkw.do?method=largePage＆id=312552

［6］张启明，李慧义.色谱分析中面积归一化法测定有关物质的弊与利［J］.中国药品标准，2005，6(4):45 －46.

［7］陈 震.有关物质的研究与新药注册［J］.中国医药工业杂志，2010，41(11):872－876.