兔大肠埃希氏菌的分离培养与鉴定

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(西藏自治区农科院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850009)

大肠埃希氏菌病是由致病性大肠埃希氏菌引起的一种急性肠道传染病，新生和幼龄动物最易感染，以发生严重腹泻、肠毒血症、败血症为特征， 各种温血动物都易感染患病。

兔大肠埃希氏菌病又名粘液性肠炎。本病是由一定血清型的致病性大肠埃希氏菌及其毒素引起的一种发病率、死亡率很高的肠道传染性疾病。

1 流行病学

本病多发于初生和断乳期仔兔，致死率很高。青年兔和成年兔的发病率和死亡率较低。近年来，各地兔场相继爆发大肠埃希氏菌病，发病率高达50%～80%，个别兔场死亡率在50%以上，给养兔业造成了严重的经济损失。

带菌动物通过排泄物或分泌物，将病原菌排出体外，污染饲料、饮水、垫草、场地用具等而传播，传播途径主要是消化道。另外当动物机体抵抗力下降、肠道内菌群失调时，原来的常住菌便迅速繁殖，毒力增强，导致内源性感染。该病也可继发于球虫及其他疾病。

本病一年四季均可发生，尤以高温高湿的夏季和秋季多发。饲养管理不良，突然改变饲料，饲料中的粗纤维含量低，饲料污染，气候突变、卫生条件差等环境应激导致肠道正常微生物菌群改变，使肠道常住的大肠埃希氏菌大量繁殖而发病。

2 临床症状

病兔精神沉郁，被毛粗乱，体温略高，食欲减退或废绝，饮水量增加，腹胀，腹泻，粪便中有胶冻样黄白色黏液，呈腥臭味，肛门周围被毛脏乱，粘有黄色水样稀粪；部分病兔便秘，粪便带有黏液，质地坚硬，病兔消瘦并严重脱水。最急性病例突然死亡而不显任何症状。

初生仔兔常呈急性经过，腹泻不明显，排黄白色水样粪便，腹部臌胀，多在1～2 d内死亡。未断奶仔兔和幼兔多发生严重腹泻，排出淡黄色水样粪便，带有大量胶样粘液和部分两头尖的干粪。

3 病理变化

病死兔腹部明显膨大，病变主要在消化道，以回肠、回盲部和结肠部最为严重。

对病死仔兔进行解剖，可见胃、十二指肠和空肠充满多量气体和液体而显膨大，黏膜上有针尖状出血点；胆囊胀大、十二指肠黄染。回肠内容物呈粘液胶冻样，空肠和回肠黏膜脱落。结肠扩张，黏膜充血，有少量出血斑点和透明粘液。直肠粪球细长，两头带尖，外面包有粘液，部分包有一层灰白色胶冻样分泌物；回肠和结肠的淋巴滤泡肿大，肠系膜淋巴结显著肿大。

初生仔兔急性死亡，腹部膨大，胃内充满白色凝乳物，并伴有气体；膀胱内充满尿液、膨大；小肠肿大、充满半透明胶冻样液体，并有气泡。可见肝脏肿大而质脆，表面有点状或片状灰黄色坏死灶，肾脏有出血点，个别肺部出现点状或片状出血。

4 实验室检查

4.1动物接种 采集自然病死兔的肝、脾、肾、心和肺部病料，将病料制成1∶5匀浆，加入青霉素和链霉素各5 000 IU/mL，置4℃冰箱中培养2 h，用灭菌注射器吸取培养后的匀浆，每只实验兔肌内注射1 mL。观察14 d，接种兔精神、食欲、粪便未见异常，健康存活。

4.2形态观察 采集病料进行涂片或触片，用革兰氏染色液进行染色、镜检。可见大量红色、两端钝圆、呈单个散在排列，不形成芽胞的G-球杆菌。

4.3分离培养 在净化工作台上，分别无菌采集心血、肝、脾、肺和肾接种于普通肉汤、熟肉基、鲜血琼脂和麦康凯琼脂培养基，置37℃培养20 h，取培养物作革兰氏染色镜检。普通肉汤和熟肉基上，细菌生长，液体浑浊；麦康凯琼脂培养基上，生长出粉红色菌落。鲜血琼脂培养基上，生长出直径约2 mm，菌落圆形、边缘整齐、表面光滑、隆起、湿润的淡灰色菌落，菌落不溶血。

再将革兰氏阴性的5个单个菌落分别进行纯培养。置37℃培养20 h，取纯培养物做涂片、干燥、固定和革兰氏染色、镜检。可见到两端钝圆的G-球杆菌。

4.4生化试验 吲哚(靛基质)试验阳性，甲基红(MR)试验阳性，硫化氢试验阳性，能使葡萄糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，发酵乳糖、蔗糖、产酸不产气。

4.5致病性试验 用灭菌生理盐水洗下纯培养物，制成悬液，接种实验兔，肌内注射0.5 mL/只，观察致病情况。可见实验兔体温升高(40.0～41.0℃)，精神不振，食欲废绝。粪便干硬并带有黏液，且于接种后24～48 h衰竭死亡。剖检病死实验兔，可见内脏器官呈败血症的病理变化。从病死兔的心血、肝、脾、肺、肾脏中再次分离得到该菌。

4.6血清学试验 菌液与大肠埃希氏菌阳性血清出现凝集现象；与沙门氏菌属诊断血清不出现凝集现象；与阴性血清的对照未见菌体自凝现象。

5 讨 论

5.1分离菌株呈革兰氏阴性，两端钝圆，多散在，肉汤中有灰白色沉淀。分离菌接种健康兔均表现为不同程度的腹泻、甚至死亡，表明兔群以腹泻为主的疾病多系致病性大肠埃希氏菌所致。

5.2据试验，分离菌均能使乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇分解。同时，经硫化氢试验、靛基质试验、甲基红(MR)试验结果为阳性，与大肠埃希氏菌的形态特征、培养特性、生化试验特征基本一致。

5.3饲养管理不良极易导致本病的发生。因此，养兔场应加强平时的饲养管理，注意通风、保温、消毒，以防大肠埃希氏菌病的发生。

5.4兔大肠埃希氏菌病是断奶仔兔的常见多发传染病，一般都是单一发病，混合感染较为少见，由于基层条件所限和兔群发病迅猛，为了尽快控制疫情扩散，主要根据发病兔群流行病学、临床症状、病理剖解变化和镜检情况即可初步诊断为兔大肠埃希氏菌病感染，经综合防治，效果明显，为今后该病的防治工作积累了经验和奠定了基础。