新疆博乐地区恙虫病东方体自然疫源地调查

党荣理，任立松，高金拽，马德新，刘小明

恙虫病是经媒介恙螨叮咬而传给人的一种自然疫源性疾病，其病原体为恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi，Ot），以鼠类为主要传染源或储存宿主。恙虫病主要发生于长江以南地区，近年来恙虫病疫情有所变化，在北方地区也出现恙虫病疫情报告［1］。我们于2008年4月至8月份对新疆博乐地区的动物感染恙虫病东方体的情况进行了调查［2］，随后在2009年到2010年间分别对可疑地区的牧民、动物宿主、传播媒介等进行了全面的调查，结果显示在新疆博乐地区存在恙虫病东方体自然疫源地，现将调查情况报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料 脾取自捕获的野鼠，血液取自可疑地区当地牧民静脉血，媒介恙螨从捕获的野鼠体表获得。昆明种小白鼠购自新疆医科大学动物实验中心SPF级实验室。

1．2 主要试剂EasyPureGenomic DNA Extraction Kit、2×EasyTaq PCR SuperMix、Marker2000（购自北京全式金生物技术有限公司），PCR凝胶回收试剂盒（购自美国Omega公司）。实验其他试剂均购自上海生工。

1．3 引物 参照Furuya［3］及 Tamura［4］设计的 Otsta M型特异引物，包括外引物和内引物，其中内引物分为群特异引物和型特异引物，由Invitrogene生物技术有限公司合成。引物序列及大小见表1。

表1 引物序列Tab．1 The sequences of primers

1．4 方法

1．4．1 媒介恙螨调查 采用检查宿主法［5］，将捕回的野鼠处死后，齐耳根剪下鼠耳，翻出耳窝，放大镜观察，用稍湿细毛笔挑入70%乙醇浸湿的指形管内，待查。根据调查结果计算带螨率及带螨指数。

1．4．2 恙螨种类鉴定 按照孟春阳等［6］提供方法，进行标本制做及种类鉴定。

1．4．3 Ot分离按照唐家琪［5］提供方法，进行病原接种、分离及鉴定。

1．4．4 标本DNA提取无菌条件下取鼠、旱獭脾组织约25mg左右（血液约100μL，恙螨约90～100只左右），切碎，置于无菌1．5mL离心管中，按照TransGen Biotech基因提取试剂盒操作步骤提取总DNA，－20℃冰柜保存待用。

1．4．5 nPCR反应 第1次PCR使用引物P34和P55，扩增体系为：Super－Mix 13μL、DNA 模板1μL、P55 0．5μL、P34 0．5μL、蒸馏水10μL，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，57℃2min，70℃2 min，30个循环；72℃10min。第2次PCR将引物改为P10和P11，用第1次PCR产物为模板，其他反应成分及条件同第1次PCR。取第2次PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，有481～507bp带者为阳性。

1．4．6 基因分型及序列同源性分析 分型引物的合成（表1），PCR扩增体系及反应条件同1．4．5条件。根据nPCR结果，将扩增产物的纯化及序列测定采用琼脂糖凝胶回收试剂盒，按说明书从凝胶中回收nPCR产物。将纯化回收的PCR产物送上海生工测序。测序结果登陆美国国家生物技术信息中心网站http／／ww／／w．ncbi．nlm．nih．gov／，与 Gen－Bank中注册的序列进行比较。

2 结 果

2．1 媒介调查结果 在平原湿地、居民区、山地草原共捕鼠154只，主要包括：小家鼠38只、普通仓鼠53只、大沙土鼠46只、草原跳鼠17只，从其中13只鼠体表分离到恙螨817只，带螨率为8．4%。恙螨经鉴定包括2个种：博乐纤恙螨（Leptotrombidium．bolei）和新疆纤恙螨（Leptotrombidium．xinjiangensis）。

2．2 病原分离结果 阳性鼠脾悬液腹腔接种1周后，发现昆明种小白鼠出现闭目、耸毛现象，未出现死亡。无菌取脾再制成悬液，进行传代接种，1周后接种鼠出现同样症状，无菌取脾，按照1．4．4、1．4．5方法步骤，提取DNA，检测Ot，结果显示，传代2次后，从接种鼠脾中检测到Ot阳性（图1），判断成功分离到恙虫病东方体。

图1 传代鼠脾电泳图1：Marker；2：传代鼠脾扩增结果Fig．1 Electrophoresis on subculturing spleen of mice1：Marker；2：Amplification results for culturing spleen of mice．

2．3 nPCR结果 在平原湿地、居民区中捕获的3类（小家鼠、普通仓鼠、大沙土鼠）脾提取的总DNA中扩增出481－507bp大小的条带，在山地草原捕获的草原跳鼠脾的总DNA中未扩增到阳性带，总的阳性率为4．5%。牧民静脉取血，提取血液中总DNA，从3份中扩增到481－507bp条带，阳性率为1．9%。推测感染人群未发病可能与病原毒性较弱有关。从博乐纤恙螨的总DNA中扩增到目的片段，未从新疆纤恙螨的总DNA中扩增到目的带（见图2）。

图2 nPCR结果M：Marker，1：平原湿地及居民区鼠脾阳性总DNA扩增结果；2：牧民血液阳性总DNA扩增结果；3：博乐纤恙螨总DNA扩增结果Fig．2 nPCR results M：Marker；1：Positive amplification results for total DNA of spleen of mice in plain wetlands and residential areas；2：Positive amplification results for total DNA of blood from herdsmen；3：Amplification results for total DNA of Leptotrombidiumbolei

2．4 基因分型结果 从鼠脾、人血、博乐纤恙螨提取的总DNA经基因分型引物扩增后，仅在Karp株引物管中有230bp左右的扩增带（图3）。

2．5 测序及同源性分析结果 经上海生工测序，核苷酸长度均为442bp。将分离株的核苷酸序列在NCBI网站进行BLAST，结果显示与Karp株的核苷酸序列同源性为97%（图4），与ISS－11、Taiwan序列的同源性为97%；与Kanda的核苷酸序列同源性为92%。BLAST结果与基因分型引物扩增结果相同。

图3 基因分型结果1：Marker；2：Gllima株引物；3：Karp株引物4：Kato株引物；5：Kuroki株引物；6：Saitama株引物；7：Kawasaki株引物Fig．3 Genotyping1：Marker；2：Primer of Gllima strain；3：Primer of Karp strain；4：Primer of Kato strain；5：Primer of Kuroki strain；6：Primer of Saitama strain；7：Primer of Kawasaki strain．

3 讨 论

1952年我国开始有恙虫病的疫情报告，至1985年每年约有1 000例病例报告，随后疫情有所平息，到1994年疫情回升，而且发病人数呈增多态势［7］。疫区范围发生变化，1985年我国恙虫病仅在北纬31°以南的广大地区流行，流行范围东至台湾，西至云南，北至浙江和湖南诸省区，南至海南及两广地区。1986年以后，恙虫病疫源地逐步北移，1986年至1998年间分别在山东、江苏、吉林、甘肃、河北等省均发现恙虫病病例［1］。

新疆博乐地区以农牧区为主，植被复杂，生境多样，有高原草场、湖泊湿地，其生境特点较为适合恙虫病东方体的生存。上世纪70年代宗定国等［8］在新疆博乐地区的牧民、绵羊、鼠类的血清中检测到Ot抗体，2008年党荣理等在新疆地区鼠类脾样本中利用分子生物学方法扩增到Ot阳性片段。但由于未能分离到病原、确定传播媒介，对该地区恙虫病东方体的自然疫源地特征始终存在诸多疑问。本课题组在前期对该地区动物感染恙虫病东方体调查的基础上，从捕获的野鼠的体表分离恙螨，对恙螨进行了种类鉴定，同时，对Ot检测为阳性的鼠脾进行接种传代，分离病原。

恙螨的鉴定结果显示，该地区主要存在2种恙螨，分别为博乐纤恙螨（L．bolei）和新疆纤恙螨（L．xinjiangensis）。通过提取DNA，nPCR扩增Ot阳性片段，显示从博乐纤恙螨（L．bolei）的总DNA中扩增到目的片段，由此判断在该地区恙虫病东方体的传播媒介可能为博乐纤恙螨（L．bolei）。nPCR扩增结果显示从鼠脾、牧民血液、恙螨的总DNA中扩增到Ot阳性片段，基因序列分析及同源性分析表明，在该地区恙虫病东方体的基因型为KARP株型。在前期研究过程中，我们分别从该地区鸟类的脾脏、绵羊血液中均扩增到了Ot阳性片段，其基因型也均为Karp型，推测新疆博乐地区恙虫病东方体的基因型比较单一，但宿主动物呈现多样性特点。从山地草原捕获草原跳鼠17只，从体表未分离到恙螨，基因检测结果为阴性。结合以前的检测结果，推测在博乐地区的恙虫病东方体的疫源地可能存在于平原湿地和城乡结合地区。

本研究结果与宗定国等［8］的有一定差异，主要体现在宿主动物、传播媒介、感染率等方面。宗定国等［8］通过补体结合实验，判断在该地区的恙虫病东方体的主要宿主动物为长尾黄鼠；传播媒介为恙螨，但对恙螨的种类未予以确认；人群感染率为20．1%，野鼠感染率为8．9%；未分离到病原。本文结果发现：当地恙虫病东方体的宿主动物有小家鼠、普通仓鼠、大砂土鼠，在鸟类中检测到Ot阳性；传播媒介为博乐纤恙螨；野鼠感染率为5．5%，人群感染率为2．0%。其差异可能与环境变化有关，以此次调查的地点之一艾比湖滩涂地区为例，与上世纪80年代相比湖面缩小了近1／3，湖边湿地沙化严重，植被、动物种类等均发生了变化，这些都可能造成恙虫病东方体的生存空间变化，随之引起宿主和感染率变化。

［1］Wu GH，Jiang ZK．Prevention and control of tsutsugamushi dis－ease［J］．Int J Med Parasit Dis，2007，34（4）：169－172．（in Chinese）吴光华，姜志宽．恙虫病的预防与控制［J］．国际医学寄生虫病杂志，2007，34（4）：169－172．

［2］Yang LP，Zhao ZT，Liu YX，et al．Genotype identification and sequence analysis ofOrientiatsutsugamushiisolated from Shandong area［J］．Chin J Epidemiol，2006，27（12）：49－52．（in Chinese）杨丽萍，赵仲堂，刘运喜，等．山东地区恙虫病东方体分离株的基因分型与序列分析［J］．中华流行病学杂志，2006，27（12）：49－52．

［3］Furuya Y，Yoshida Y，Katayama T，et al．Serotype－specific amplification ofRickettsiatsutsugamushiDNA by nested polymer chain reaction［J］．J Clin Microbiol，1993，31：1637－1640．

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［7］Zhang Q，Liu YX，Wu XM，et al．Investigation on rodents＇natural infection ofOrientiatsutsugamushiin some areas of Inner Mongolia and Xinjiang，China［J］．Chin J Epidemiol，2006，27（6）：475－478．（in Chinese）张倩，刘运喜，吴晓明，等．中国内蒙古、新疆部分地区鼠类自然感染恙虫病东方体的调查［J］．中华流行病学杂志，2006，27（6）：475－478．

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