常见染色体病的快速产前诊断方法

陶华娟 张艳 郎翠红

（潍坊市妇幼保健院 遗传科，山东 潍坊 260011）

1 前 言

染色体不分离和结构不平衡在新生儿中的发生率为1／200［1］，成为发育缺陷和先天畸形的主要原因。因此，细胞遗传学分析一直被认为是很重要的有创性产前诊断方法。

从1966年首次应用孕中期羊水脱落细胞培养或孕早期绒毛采样进行产前检测，到19世纪70年代常规应用染色体显带分析（核型分析）以来，此方法已经成为经典的产前诊断技术［2］。核型分析作为一种可靠的方法，可以诊断染色体数目异常及500万至1000万对碱基对的结构重排。羊水细胞核型分析的准确率为99.4%～99.8%，绒毛膜细胞核型分析的准确率为97.5%～99.6%［3］。然而，核型分析的局限性在于必须进行细胞培养，大多数临床实验室出报告的时间为10～14天。

近10年来，21-三体综合征及其他染色体疾病的无创筛查技术已有了根本性提高。为了改善孕期管理和缓解孕妇焦虑的情绪，需要一种快速的方法来确诊这些疾病，且大量临床研究表明这些方法能在产前诊断中检测出大多数的染色体异常。因此，将传统核型分析作为经典产前诊断方法保留还是被快速的方法所取代还存在争议。本文将讨论临床上最常用的3种快速诊断非整倍体染色体疾病的方法：分裂相的原位荧光杂交（iFISH）、荧光定量聚合酶链反应（QF-PCR）、多重连接探针扩增技术（MLPA）。

2 方 法

iFISH、QF-PCR、MLPA 和其他一些新的方法可以快速检测（约1～2天）最常见的常染色体异常如13-三体（帕塔综合征）、18-三体（爱德华综合征）和21-三体（唐氏综合征），而性染色体异常如特纳综合征（单体X）、克兰费尔特综合征（XXY）和三倍体，嵌合体和结构重排，包括平衡和不平衡易位、大量的基因缺失和复制、插入和标记染色体等，只有很少一部分能够在产前检测。

2.1 荧光原位杂交技术 近20年来，荧光原位杂交技术（FISH）技术有了很大的发展。相对于传统的核型分析来说，FISH 能更好地检测和分析某些罕见的染色体结构异常，包括微缺失综合征、隐匿性的或轻微的基因复制和置换、复杂的重排和标记染色体。它是通过特定的染色体探针来检测羊水或绒毛样本中的分裂间期的细胞，从而快速（需1～2个日）诊断常见的非整倍体染色体疾病。通过这种方法，可以避免传统核型分析中因需要进行细胞培养而延误报告时间。大量研究发现，用于对分裂间期的细胞核进行FISH 检测的商业化试剂盒的灵敏度和特异度都很高，且在诊断应用中也被证实。许多实验中心现在都依据FISH 检测结果，如发现常见的三体时，就不需要等细胞培养后的核型分析结果了。但是，分裂间期FISH 检测方法因使用探针而受到限制，许多罕见的染色体结构和数目异常均不能被检出。因此FISH 的结果有时有局限性，仍需要核型分析来最终确诊。

在产前诊断中应用FISH 检测的同时仍需要同时进行传统的核型分析，因为其仅能快速诊断非整倍体染色体。

2.2 荧光定量聚合酶链反应 在欧洲，最常用的快速检测非整倍体的产前诊断方法是荧光定量聚合酶链反应（QF-PCR）。QF-PCR 检测的原理是建立在选择性的短串联重复片段（STRs）基础上，这些片段是由2～5个核苷酸组成的基因片段多次重复形成的。这些片段的多态性与某一特定位点重复的数量不同有关，进而产生了不同长度的等位基因。STRs很容易通过PCR 扩增多态性片段来检出，它产生的荧光产物与目标片段的数量是成正比的。QF-PCR可以通过非多态性釉质（AMXY）基因进行性别鉴定，可依据此基因序列的不同来鉴定不同长度的X-、Y-特定产物，此外，通过分析此基因序列还可以鉴定性染色体数目异常（47，XXY，47，XYY，48，XXXY）［4，5］。

经过最初的实验室和临床试验后，QF-PCR 检测方法已在几个产前诊断中心被常规使用（主要在欧洲地区）。它能借助羊水标本和计算机系统来正确诊断所有正常的染色体核型，13、18、21-三体，双三体（48，XXY，t21；48，XXY，t18）及非嵌合的性染色体异常，通常在24～48小时出检测报告，能缓解超过95%的父母因等待核型分析结果产生的紧张情绪［6，7］。到目前为止，已经有超过25万个样本使用QF-PCR 检测，虽然不同的中心使用的试剂盒不同，但它的结果是真实可靠的，没有假阳性和假阴性结果。

目前还没有关于QF-PCR 的假阳性报道，在许多国家和机构将其作为一种是否终止妊娠的依据，而不需要等待核型分析的结果。

2.3 多重连接探针扩增技术 包括QF-PCR 在内，多重连接探针扩增技术（MLPA）是第二种以PCR 为基础的检测非整倍体染色体疾病的方法。它是一种以PCR 为基础的多样化的方法，主要是用来决定反应管中超过50个基因的DNA 或RNA 序列的拷贝数［8］。这个技术应用广泛，其中SALSA P095试剂盒是专门用来检测产前诊断中常见非整倍体疾病的。

在这个试剂盒中，13、18、21、X 染色体均分别对应8个基因座，而Y 染色体对应4个基因座。正如用QF-PCR 检测单位点的结果需要与相同样本的基因座结果相比较，同样，用MLPA 检测单位点的结果也需要有相应的对照，这个对照是指检测二倍体DNA 样本的相同基因座的结果，最终得出一比率。如果这个比率接近于1，那么该基因座中DNA的量与对照组是相同的，即也是二倍体。如果该比率＜0.7或＞1.3，那么该基因座中DNA 的量就会少于或多于对照组。故而，依据8个（13，18，21和X）或4个（Y）染色体基因座的结果就能算出相关染色体拷贝数。

与FISH 和QF-PCR 相比，MLPA 不能检测 出女性的三倍体。因为不管在正常女性还是三倍体女性染色体中，X 染色体和常染色体的Ratio值是相同的。然而，三倍体的女性胎儿均伴有超声的异常，因此可通过超声诊断来预防三倍体患儿的出生。

就像FISH 和QF-PCR，在许多实验室已经将MLPA 作为决定是否终止妊娠的依据，而不需要等待核型分析来确诊［9］。

3 困难和策略

3.1 绒毛膜绒毛 绒毛存在于不同的细胞系中：即细胞滋养层细胞系和间充质核细胞系，这种现象将影响绒毛的分子生物学研究。核型分析表明，这些细胞系之间可能会出现遗传差异。

荧光定量PCR（QF-PCR）和核型分析结果之间的微小差异已有报道。在大多数情况下，研究的仅仅是单一的绒毛膜绒毛，而与绒毛膜绒毛相关的嵌合现象可引起结果的微小差异［10，11］。

Mann等［12］研究表明，将细胞滋养层的外层用消化酶去掉后，仅对从间质核细胞分离出的DNA进行MLPA，MLPA 的结果与核型分析的结果完全一致。这些核型分析的样本来源于相同细胞型分裂中期的细胞（长期培养分析）。Kooper等［13］研究了7个绒毛膜绒毛的MLPA 资料。这些资料表明，不管是短期培养还是长期培养，核型分析结果均有差异。然而他们用蛋白酶K 消化整个绒毛后，导致了来源于滋养层细胞的DNA 过表达（在短期培养中）。并且用酶消化法分离了来源于间质核的滋养层细胞，然后分离出来的DNA 进行了MLPA 检测和核型分析，并且尽量均行短期与长期细胞培养，发现MLPA 的结果与核型分析的结果一致。这表明，经酶消化产生的细胞碎片与用于核型分析的碎片结构差不多。

3.2 母细胞污染 在产前诊断中一个最常见的现象是母体细胞的污染。因为母体的细胞不能或很难在长期培养中生长，因此一般不会影响核型分析的结果。然而，在理论上，这一现象可影响分子学的方法（包括FISH），因为这些检验用的材料是未经培养的细胞。

包括应用QF-PCR，我们希望能够通过放大的高度多态性的STRs序列来发现新的等位基因或者在所有染色体之间非对称性的特征型基因。这些序列一般不同于正常的、三体的或者三倍体的序列。所以可依据这些序列来进行检测，而不存在误诊的情况。正因为这样，在生长缓慢的CVS 培养中，QF-PCR 有助于分别出正常的母体核型来确定所检测的细胞是胎儿来源的细胞，进而排除母体细胞的过度生长。

不同于QF-PCR，有人用MLPA（和FISH）研究了单拷贝基因座或染色体区的拷贝数，而不是在单位点上的等位基因数。结果表明，不会在女性胎儿中检测到母细胞的污染。在男性胎儿中，仅仅X和Y 基因座的比率异常时，才怀疑母细胞污染。事实上，所有的MLPA 研究均有可能因母细胞污染而导致误诊。然而，MLPA P095 检测嵌合体的最低下限是-20%［13］。因此，从胎儿和母体DNA 混合物获得的胎儿嵌合的DNA 来行MLPA 检测，即使在母体细胞污染率高达80%时，也可能发现胎儿三体性疾病。

3.3 嵌合现象 嵌合现象在产前诊断技术中很常见，但诊断有时比较困难。对常规的核型分析来说，嵌合现象的检测水平主要是由被分析细胞的数量决定的。例如，当分析10 个分裂中期的细胞时，有26%的嵌合现象被排除（95%的置信区间），而当分析12 个时，23%的嵌合现象被排除（95%的置信区间）。

大部分分子生物学实验方法能够检测到更低水平的嵌合现象，但仍有不到10%～20%的嵌合现象没有被检测到。就像核型分析一样，在检测2个或更多细胞系时，FISH、QF-PCR 和MLPA 的灵敏度主要决定于嵌合现象的水平和相关的染色体。比如，应用FISH 技术，46，XX／45X 的嵌合体能够很容易的检测出来；而对QF-PCR 和MLPA 来说，当异常细胞系不足20%时，这些嵌合能够通过X 染色体标志的不平衡等位基因比率来识别［14］。45，X 和47，XXX 细胞等比嵌合的现象，不能用QF-PCR 或MLPA 检测出来，因为这就像在正常的女性胎儿一样，这些细胞产生了相同的等位基因比率。但是，用FISH 则可轻易检测。

X 染色体嵌合现象中的一些病例中，分子生物学与细胞遗传学关于异常细胞亚群百分率的差异，可能是由于正常（46，XX 或46，XY）和45，X 细胞生长速度不同引起的，因为非整倍体细胞系生长普遍比正常细胞快［15］。性染色体的嵌合体45，X／46，XY，尽管能够轻易的用分子生物学方法检测到，但是经过细胞培养后常常成为单纯的45，X 核型。

上述3种方法中的任何一种，理论上都可以大规模地应用于非整倍性的检测，但FISH 因花费很高，并且耗时，故而QF-PCR 和MLPA 成为最通用的检查手段，后两者的主要优点之一是自动操作。目前，在产前诊断中对非整倍体染色体疾病使用快速检测最主要的目的是提高孕期管理，或是为那些超声显示无明显异常的大多数患者快速提供检测结果，可以短时间内减少焦虑和压力。

这些快速产前诊断方法的使用在一些国家中仍有争议，因为最近一些研究发现有些患者的超声显示正常且QF-PCR 检测没有发现的染色体异常，进而出现了漏诊的情况［16］。

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