发芽糙米γ－氨基丁酸的检测及研究进展

刘红梅，魏淘涛，刘行丹，刘建丰

(湖南农业大学农学院/作物生理与分子生物学教育部重点实验室，湖南长沙410128)

糙米的发芽过程是一个酶解过程［1］，大量的酶被激活和释放，并从结合态转化为游离态，这特定的生理活性化过程，使发芽糙米具有多种药理功能。其中，在谷氨酸脱羧酶的作用下由谷氨酸转化而成的γ－氨基丁酸 (GABA，又名氨酪酸)，是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于动植物及其各部位中，是哺乳动物中枢神经系统内重要的氨基酸类神经递质，具有降低血压，抗动脉硬化，使脑部血液流量活跃，促进乙醇代谢，降血脂、防止肥胖、消除体臭的作用［2，3］。

1GABA的含量检测

对发芽糙米GABA的研究，含量检测是各项工作的基础，尤为重要。国内外学者探索过的GABA测定方法有改良的Berthelot比色法［4］、氨基酸分析仪法［5］、改良纸层析法［6］、液相色谱法［7］、薄层扫描法［8］、毛细管电泳电化学法［9］、柱层析荧光法［9］、纸电泳比色［9］等。前 4种方法应用较普遍，分述如下。

1.1 比色法

Berthelot比色反应是利用苯酚和次氯酸钠与游离氨反应形成蓝绿色化合物，常用来测定不同体系中微量氨及其盐类。由于GABA反应灵敏，α－氨基酸响应低，利用两者的响应差别悬殊，进行GABA的鉴定。陈恩成等［4］应用此法，用60%乙醇溶液提取糙米和发芽糙米粉中的GABA，在70℃下回流提取2 h，其离心上清液以重蒸苯酚和次氯酸钠溶液作为显色剂显色反应，在645 nm处比色测定，以标准品为对照计算样品中GABA的含量。结果表明:该法简单、快速、经济，相对标准偏差(RSD)0.98%，平均回收率99.4%，适合于批量分析GABA。

1.2 改良纸层析法

张晖等［6］应用改良纸层析法分析GABA，结果表明:点样量在8～40 μg，点样线距滤纸2.0 cm，样品间距2.0 cm，展开体系 (正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶3，0.4 g/d L茚三酮)，90℃烘干显色 10 min，洗脱液 (1 g/L硫酸铜∶75%乙醇=2∶38)，10～50 min内520 nm处比色能得到较好的结果。此法简单易行，耗费低廉，可作为GABA分析检测的方法之一。

1.3 氨基酸分析仪

钱爱萍等［5］用氨基酸自动分析仪比较了53 min标准程序与30 min短程序快速测定发芽糙米和中药材中的GABA含量。用0.02 mol/L柠檬酸缓冲液配置标准溶液，样品粉碎过筛，用0.02 mol/L盐酸溶液溶解并加入6%磺基水杨酸15 mL于沸水浴中加热回流5 min，振荡30 min后，用pH 2.2柠檬酸缓冲液定容至50 mL，室温下静置1 h后，取离心上清液，用0.45 μm过滤膜过滤后待上机测定。结果表明:两种程序测定结果相对误差小于3%，峰位置和峰面积重现性变异系数分别为0.17%和0.23%，回收率97.89%～101.2%。该改良方法稳定、快速、准确，适于GABA的测定。

1.4 液相色谱法

因GABA本身对紫外光吸收不灵敏，所以液相色谱法一般采用柱前衍生引入具有强紫外吸收的基团，再进行检测。衍生试剂类型很多，常用的有邻苯二甲醛 (OPA)、丹酰氯 (Dansyl－Cl)、2，4－二硝基氟苯 (FDNB)、异硫氰酸苯酯 (PITC)、氯甲酸芴甲酯 (FMOC)、6－氨基喹啉基－N－羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯 (AQC)和2，4－二硝基氯苯 (CDNB)等。其中，房克敏等［7］采用AQC为柱前衍生试剂，Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱，梯度洗脱，紫外检测波长248.0 nm，分析了16种发芽糙米，得到GABA保留时间23.051 min，线性范围0.10～1.0 μmol/mL，线性方程为y=3.0 106x－7877.6，r=0.9999，回收率为 99.0% ～100.5%，相对标准偏差小于1.1%。该法抗干扰能力强，且易于操作、稳定、灵敏、准确。

2 发芽糙米GABA研究进展

2.1 国外研究概况

1964年日本曾提倡国民食用糙米，每天一餐，但终因口感差而难以推广。1994年T.Saikusa［10］在改善稻米食用品质试验中，首先发现糙米发芽后，游离氨基酸的组成和含量发生了显著变化，其中主要集中在胚芽部分的GABA含量大幅度提高。同年，T.Saikusa又检测了日本10个不同品种的稻米胚芽富集GABA的情况，结果发现不同品种的米胚芽富集GABA的能力有很大差异，其中GABA富集最高的是巨胚米。

2001年，日本农林水产省食品综合研究所和日本中国农业试验场，共同研究开发成功世界首例发芽糙米［11］，并已产业化、商品化。目前日本市场采用真空包装的发芽糙米价格是糙米的2倍。由于发芽糙米比糙米的营养价值和生理活性具有明显的优势，且烹煮便利，口感类同于大米饭，因而一上市即得到消费者认可。有专家预言:发芽糙米可能将成为21世纪人类的主食资源［12］。

日本学者茅原［13］认为，发芽糙米中的GABA含量升高是因为:在发芽过程中谷氨酸脱羧酶被激活，导致糙米本身所含的谷氨酸以及蛋白酶水解蛋白质生成的谷氨酸脱羧生成GABA。

爱岩［14］、三枝贵代［15］、衫下朋子［16］等通过对米胚芽GAD酶学性质的研究发现，微酸环境利于GABA的产生 (最适pH为5.6)，碱性条件下GABA含量不增加;最适温度为40℃，米胚GAD对谷氨酸 (Glu)的Km值为32.37 mmol/L，超过60℃，酶活性基本丧失。在最适条件下米胚芽浸泡4 h，可使GABA富集达400 mg/100 g，约提高10倍。另外，钙离子可用来激活米胚GAD，从而提高GABA的产量。Panatda Jannoey［17］采用5个广泛栽培的常规水稻品种 (PL2，CN1，KDML105，SP1，PT1)，以LC－MS法分析谷氨酸和GABA，研究了糙米发芽过程中GABA的动态变化过程，结果发现:所有品种的谷氨酸含量存在显著差异，糙米发芽后20～30 d，嫩叶里GABA含量急剧增加，认为发芽20～30 d的嫩叶可作为制药的原材料。

Komatsuzakia Noriko［18］认为浸泡 3 h 加通气处理21 h，35℃，相比只浸泡处理，GABA含量从10.1 mg/100 g增加到24.9 mg/100 g。通20 min蒸汽和用乙醇处理3 min，能完全消除发芽过程中滋生的微生物的影响，而对GABA的含量没有任何影响。

Mithu Dasa等［19］认为曲霉属真菌和木霉属菌能产生木聚糖酶和纤维素酶，用这两种酶处理发芽糙米2 h，50℃，然后35℃浸泡24 h，GABA的含量升高到27 mg/100 g，而脂肪和纤维含量显著降低。

Anuchita Moongngarm［20］对普通糙米和黑米的化学成分进行了比较研究，发现两种米发芽后GABA、甘氨酸、赖氨酸和亮氨酸含量均显著增加。

2.2 国内研究概况

2.2.1 加工研究

与日本等发达国家相比，我国在发芽糙米富含GABA水稻新品种选育，及相关产品开发方面落后很多，起步较晚。到目前为止，已有隆平粮社、麻阳鸿达实业有限公司、烟村公司等6家单位的发芽糙米产品相继问世。

中国农业大学李再贵与日本学者辰巳英三［21］，于2003年研究了发芽糙米的前处理脱脂技术及发芽过程中GABA含量的变化情况，认为品种不同，GABA含量变化也不同。脱脂处理 (40℃，2 h)无论是对原料还是发芽糙米，都有利于提高GABA的含量。脱脂的发芽糙米GABA含量比没有脱脂时提高80 mg/100 g，提高近三分之一。另外，对发芽条件 (温度、pH值和时间)进行了单因素试验，认为40～50℃处理4 h，pH5～6，能使米胚中的GABA得到有效地富集。还指出发芽糙米与普通大米按1∶5的比例混合煮饭，与普通米饭的口感几乎没有区别。

顾振新等［22］用赤霉素处理对糙米发芽力及其主要成分变化的影响进行了研究，认为GA3处理能显著提高发芽糙米中淀粉降解量和还原糖、水溶性蛋白质、游离氨基酸含量，其中以0.20 mg/L赤霉素处理的为最高。张绪璋等［23］也认为生长素GA对富集GABA有一定的促进作用，能使发芽糙米GABA含量提高4倍。

刘玲珑［24］研究了GABA含量及其合成关键酶(谷氨酸脱羧酶)的变化动态，认为GABA主要集中在胚部，随着浸水时间延长，GAD的活性呈逐渐增加趋势。GAD活性变化与GABA的积累呈显著正相关，表明浸水后种胚GABA的积累与GAD的催化反应有关。张晖［25］得到米胚GAD的最适反应温度为40℃，最适反应pH为5.6。米胚GAD的热稳定较差，75℃时酶基本完全失活。但米胚GAD在较宽的pH范围内 (pH4.5～8.0)都较为稳定，能保持88%以上的酶活。Ca2+浓度达到500 μmol/L时对米胚GAD的激活作用最强，可使酶的相对活性达到145%，Ca2+能提高酶与底物的亲和力，对米胚GAD的活性有较强的激活作用。李冰冰等［26］比较了糙米与稻谷发芽期间及发芽结束后GAD活力、GABA和谷氨酸 (Glu)含量的变化。结果表明，糙米和稻谷在 (32±1)℃条件下以1.2 L/min通气量，用含有0.1%L－谷氨酸和0.1%抗坏血酸的培养液浸渍发芽，生长速率和呼吸速率均以糙米为快。王玉萍等［27］则认为发芽糙米以1.0 L/min通气量为最佳。培养结束时，发芽糙米中GABA含量和Glu含量分别比发芽稻谷增加64.05%和14.68%，整个发芽期间糙米中GAD活力始终高于发芽稻谷。

张燕等［28］以“豫粳6号”粳米为材料，分别用蒸馏水、电生酸性水、电生碱性水、1%次氯酸钠溶液杀菌剂进行清洗或浸泡。结果表明，用杀菌剂清洗比浸泡时还原糖和GABA含量都要高，其中用电生酸性水清洗的发芽糙米还原糖和GABA含量最高并能明显抑制糙米发芽过程中细菌的滋生。

江湖等［29，30］研究了亚硒酸钠处理对糙米发芽GABA的影响，建立富硒发芽糙米发芽率与γ－氨基丁酸含量的数学模型，富硒发芽糙米的最佳工艺参数为:浸泡液中亚硒酸钠质量浓度5 mg/L，浸泡时间9 h，浸泡温度28℃，培养时间21 h，培养温度31.5℃，发芽率77.67%。研究也认为0.2%氯化钙溶液处理有较好的富钙能力。

马涛等［31］对糙米发芽条件进行优化，认为，糙米发芽最佳条件为:发芽温度37.5℃，发芽时间28 h，氯化钙溶液浓度0.5%。

邓宇［32］研究了温度、时间、pH值及不同营养液对发芽糙米GABA含量的影响，得出:30℃下浸泡10 h后发芽24 h，糙米GABA含量达51.5 mg/100 g。pH5.5的营养液，0.15 mmol/L Ca2+，2.0 mmol/L磷酸吡哆醛 (PLP)，2.00 mg/mL谷氨酸钠，1.5 mmol/L VB6浸泡发芽糙米，均能有效调节糙米富集GABA。

2.2.2 品种研究

中国水稻研究所［33］应用生物工程技术诱发水稻组织中L－谷氨酸脱羧酶变异，选育出L－谷氨酸脱羧酶活性高、能合成大量GABA的突变体，于2003年培育出一种富含GABA的巨胚水稻新品种，该品种GABA含量比一般品种高5～6倍。

姚森等［34］、张绪璋等［23］的试验结果表明，不同品种发芽糙米的GABA含量存在明显差异。姚森还比较了不同品种发芽糙米GABA含量、GAD活性和谷氨酸转化速率等，认为早稻品种显著高于中稻和晚稻，籼稻稍高于粳稻，可能是由GAD酶活性差异所致，差异最高87.88 mg/100 g，最低34.62 mg/100 g，平均含量56.84 mg/100 g。发芽糙米的GABA生成量与芽长、糙米原料中谷氨酸含量、GAD活性呈极显著正相关，谷氨酸与蛋白质含量也成极显著正相关。孙向东等［35］和康彬彬［36］等的研究结果表明不同品种间的GABA含量差异在1倍以上，发芽糙米的GABA含量与糙米原料中谷氨酸含量呈极显著正相关、谷氨酸含量与蛋白质含量也是极显著正相关。靳祥等［37］研究表明，粳稻回交后代GABA含量高于籼稻回交后代，有色米高于无色米，不同回交世代GABA含量差异较大，在水稻GABA高含量育种方面，对早世代材料选择更易获得高GABA材料。

3讨论

3.1 关于GABA的含量检测

由于GABA对电化学、紫外－可见光及荧光不灵敏，用直接法测定要求样品前处理纯净，样品单一，当批量分析时只分析GABA一种氨基酸，可以采用改良的比色法。此时，需要注意添加试剂的顺序不能颠倒，严格控制加热显色的温度和时间，否则显色效果不理想，影响数据的准确性。如果待测样品数量少，精度要求较高时，可以选用氨基酸分析仪或液相色谱法。选前者，要配选合理的分离柱、流动相及洗脱梯度，防止α氨基，α肽等物质的干扰，以免使结果偏高。某些实验室不一定具有专门的氨基酸分析仪，可以用液相色谱，此法常采用柱前衍生，此时，选用合适的衍生剂是关键。OPA应用最广泛，但衍生产物不稳定，信号衰减快，所以多用于全自动的在线分析;Dansyl－Cl，Dabsyl－Cl，FMOC容易生成多级衍生产物，给后续分离带来麻烦和压力;FDNB在室温下即熔融，不便于操作;而PITC毒性大，对柱子的寿命影响也大，且需专门的衍生装置在无水状态下衍生。近年来，新兴的衍生剂有AQC和CDNB等，AQC衍生迅速、衍生物稳定、紫外检测灵敏度高，抗干扰能力强，但衍生试剂昂贵;CDNB和FDNB一样具有二硝基苯基团，衍生原理和FDNB类似，相比FDNB价廉易得、理化性质稳定、衍生操作方便简单。

3.2 关于发芽糙米的GABA研究

近十年以来，国内学者对发芽糙米及相关制品的研究重点集中在糙米发芽技术和发芽工艺上，大多数研究者选用一个或几个品种，研究糙米发芽的最佳技术参数和不同的品种间含量差异，得到的最佳参数也有所不同，缺少对不同水稻品系全面系统的研究。我国水稻品种类型繁多，今后应对不同水稻品种发芽糙米中GABA含量差异形成的原因及基因型进行分析，以筛选出高GABA含量及高GAD活性的品种，为农产品深加工企业提供优质原材料。而目前对这方面的研究很少，可靠有用的科研成果不多。

高GABA含量是可以遗传的性状，因此要加工富含GABA的发芽糙米制品，首先要从品种选育着手，尤其是我国的杂交稻面积已占水稻总面积的60%，可以说南方籼稻区的大部分人每天都是以杂交稻米为主食，因此选育富含γ－氨基丁酸的发芽糙米专用杂交稻组合对于提高人民的生活水平、预防或治疗相关疾病具有重大的社会效应。并且随着这种专用杂交稻组合的推广，还可以带动相关产业的发展，对于增加农民收入和解决城市人口的就业问题具有重要意义。

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