针刺夹脊穴对大鼠椎间盘LI-1α、TNF-β浓度及MRI影像影响的实验研究*

吴 曦，刘凤阁，杨建业，张自力，董军立

(湖北医药学院附属人民医院，湖北十堰442000)

传统中医针灸作为腰椎间盘突出症(Lumber disc herniation，LDH)重要的治疗手段之一，在临床上使用广泛，笔者于2011年12月至2012年2月通过针刺腰椎间盘突出症大鼠模型夹脊穴进行实验，观察针刺夹脊穴对腰椎间盘突出症大鼠椎间盘LI-1α、TNF-β浓度及MRI影像的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康3月龄雄性SPF级SD大鼠30只，体重(200±20)g，来源于湖北十堰市动物实验中心，来源号NO.00021069，按1～30编号后，使用随机排列表法将大鼠随机分为针刺干预组(A组)10只、对照组(B组)10只、正常组(C组)10只。

1.2 实验试剂与仪器

常用注射器5号针头(距针尖3 mm处有限位器)，常用动物实验手术器械，苏州华佗牌一次性针灸针(直径0.3 mm)，美国 GE1.5TMRI成像系统，南京建成生物研究所LI-1α、TNF-β试剂盒(批号为：20111224、20111219)。

1.3 方法

1.3.1 动物造模及干预

A组：禁食水1天，逐只行SPF级别手术。方法：10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉，麻醉满意后俯仰卧位固定鼠板，腹部备皮，消毒，铺巾。腹部正中切口(以髂嵴最高点为切口中点，长1.5 cm)，分层切开腹壁，分离腹膜，用玻璃棒将腹腔肠管推至右侧，可见腹主动脉、后腔静脉、髂腰动静脉，钝性分离后腹膜，后用玻璃棒将上述血管予以保护，后剥离L5～6、L6～S1两椎间盘左侧腰大肌、韧带及骨膜，暴露椎间盘左前缘，后用5号针头(带限位器)分别刺入上述椎间盘3 mm后退针。后生理盐水1 ml、氨苄西林100 mg灌洗腹腔，分层缝合，消毒，无菌敷料创口，待大鼠复醒后禁食水12 h，每日皮下注射氨苄西林50 mg，连续3天。术后分笼饲养4周后，取大鼠双侧L5、L6夹脊穴(脊柱正中旁开3 mm)，直刺0.5 mm，行平补平泄手法3次后，留针持续20 min。每天1次，连续10天。

B组：造模方法同A组，不干预，正常分笼饲养。

C组：不行造模及干预，正常分笼饲养。

1.3.2 MRI检查

造模后及干预后随机(随机排列表法)选取A组、B组、C组大鼠各5只，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉后胶布固定于纸板上，行MRI检查(矢状位)。参数：T2WI：TR 值 2960.0 ms，TE 值 102.6 ms，FOV120 mm，层厚3 mm。参照 Thompson标准［1］，将退变椎间盘分为4级：1级：T2WI信号正常;2级：T2WI信号轻度减低;3级：T2WI信号中度减低;4级：T2WI信号明显减低。测量椎间盘高度：测量L5～6、L6～S1椎间盘上下缘中点连线长度。

1.3.3 椎间盘LI-1α、TNF-β酶联免疫检测

完成MRI检查后，所有大鼠全部麻药过量处死，取 L5～6、L6～S1椎间盘及终板，剔除附着组织，大量PBS缓冲液冲洗后，放在-80℃冰箱保存。后集中取出，称重后分别放置研钵中，分3次反复加入液氮共约20 ml，研碎，加入PBS缓冲液1 ml后离心(10 000转/min、持续10 min)，取上清液。ELISA操作步骤按试剂盒说明逐步完成，后450 mm波长测量测试各孔吸光度(OD值)。记录数据并计算样品浓度。

1.4 统计学处理

计量数据采用均值±标准差，检验方法采用t检验。计数数据采用卡方检验。

2 结果

2.1 大鼠椎间盘MRI检查

2.1.1 大鼠 L5～6、L6～S1椎间盘 MRI分级

表1 A、B、C 各组造模后、干预后 L5～6、L6～S1椎间盘MRI分级对照

由表1可见A、B组在造模后及干预后无统计学差异(P ＞0.05)。

2.1.2 实验后大鼠椎间盘MRI表现 见封三图1、2、3。图1正常组MRI可见 L5～6、L6～S1椎间盘高度正常，椎间隙未见明显狭窄，无椎间盘突出。图2针刺干预组MRI表现为L5～6、L6～S1椎间盘信号明显降低，间盘内含水量明显降低，椎间盘高度下降，椎间隙变窄，椎间盘后缘部分向椎管内突出，同时L5、L6、S1椎体部分信号降低。图3对照组MRI表现与图2表现基本相同。

2.1.3 大鼠 L5～6、L6～S1椎间盘高度比较

表2 A、B、C各组造模后、干预后椎间盘高度对照 (mm)

由表2可见，A、B 两组 L5～6、L6～S1椎间盘在造模后、干预后无统计学差异(P＞0.05)。

2.2 大鼠椎间盘内LI-1α、TNF-β浓度比较

表3 LI-1α、TNF-β浓度对照A、B、C各组干预后椎间盘

由表3可见，干预后A组与B组大鼠椎间盘LI-1α、TNF-β 浓度有显著差异(P ＜0.01)。

3 讨论

华佗夹脊穴(简称夹脊穴)，从古至今备受历代医家重视，夹脊穴的应用最早见于《素问·刺疟》：“十二疟者，……又刺项以下侠脊者必已”。《素问·缪刺论》亦曰：“邪客于足太阳之络，令人拘挛背急，引胁而痛，刺之从项始数脊椎侠脊，疾按之应手如痛，刺之旁三瘠”。根据穴位的近治、远治作用，腰夹脊穴电针可以作用于局部即腰椎、椎间盘、附近肌肉神经等(近治)，也可通过足太阳膀胱经联系作用于下肢尤其是下肢后侧、后外侧区域(远治)。同时现代解剖证实腰夹脊穴位置在腰骨纤维孔、骨纤维管等结构附近，上述结构分别行走腰神经后支、腰神经后内侧支。

腰椎间盘突出症机制尚未完全明确，传统单纯考虑机械性压迫因素，但目前大量研究证实，其化学性炎症介质、免疫性炎症介质及细胞因子(CK)及神经源性炎症介质在其发生中起重要作用［2］。目前普遍认为化学性刺激、炎性介质浸润、免疫反应、机械性压迫等因素共同参与腰椎间盘突出症的发病。而LI-1β、TNF-α则是与腰椎间盘突出症、腰椎间盘退变密切相关的细胞因子。LI-1β是一种主要由单核巨噬细胞产生的重要细胞因子，具有广泛的生物学活性，主要在细胞免疫中发挥调节作用，其作为炎症介质具有细胞损伤、破坏作用，Solovieva等［3］对IL-1多分子聚体和椎间盘的退变关系的相关性进行了研究，认为其是椎间盘退变的始动因素。TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞产生，具有杀伤或抑制肿瘤细胞、调节细胞分化、促进细胞增殖、免疫调节等作用。田华等［4］通过大鼠软骨细胞体外培养证实，TNF-α能明显促进软骨细胞MMPI及MMP3的表达，对TIMPI的表达无影响，因此TNF-α对椎间盘细胞(软骨细胞)具有一定损伤作用。

MRI可以进行矢状位、冠状位、横截面等多平面成像，能对椎间盘退行性变进行早期评估，是目前椎间盘退变最精确、最简便而又无创性的检查方法［5～6］。随着MRI技术的普及，该技术越来越多的应用于临床及动物实验。椎间盘退变时，随着椎间盘病例损伤的发生、水分、含氢量的改变，导致其形态和MRI信号减低，以T2加权限最为敏感，故该技术可以精确的反映腰椎间盘突出症椎间盘在形态学上的变化，亦能相对精确的反映椎间盘含水量(含氢量)。

笔者通过实验证实针刺夹脊穴对腰椎间盘突出症大鼠椎间盘内LI-1α、TNF-β浓度有明显的抑制作用。同时证实短期内(4周)针刺夹脊穴对腰椎间盘突出症大鼠椎间盘高度、退变程度无明显影响，与对照组无统计学差异。这在一定程度上证实了临床针刺夹脊穴治疗腰椎间盘突出症一个常见问题：部分患者针刺前后虽然影像学检查无明显差异(突出物位置、突出程度、突出物大小)，但症状能够得到一定控制，可能与椎间盘及椎管内炎性因子受到抑制，进而椎间盘内及椎管内炎症反应减轻、神经根损害减轻相关。但针刺夹脊穴对腰椎间盘突出症椎间盘远期病理进程影响、远期MRI形态影响未能涉及，可在今后进一步研究。

［1］ Masuda K，Aota Y，Muthleman C，et al.A novel rabbit model of mild，reproducible disa degeneration by an annulus needle puncture：correlation between the degree of disc injury and radiological and nistological appearance of disc degeneration［J］.spine，2005，30(1)：5-14

［2］ 韩丽丽，杨晓秋，刘丹彦.腰椎间盘突出症相关炎性介质的研究进展［J］.山东医药，2010，50(19)：113-114

［3］ Solovieva S，Kouhia S，Leino-Arjas P，et al.Interleukin-1 Polymorphisms and intervertebral disc degeneration［J］.Epidemiology，2004，15(5)：626-633

［4］ 田华，党耕町，娄思权，等.肿瘤坏死因子α导致软骨损伤的机制探讨［J］.中华外科杂志，2000，38(1)：76

［5］ 尚铁松，王云钊.腰椎问盘退变的X线、MRI表现与病理对照［J］.中华放射学杂志，2002，36(9)：828-832

［6］ Xi YM，Hu YG.Development of intervertebral disc degeneration model［J］.Chin J Orthop，2000，20(6)：378-380