2例复杂热性惊厥儿童GABRG2基因突变分析

孔庆英，石 岩

热性惊厥（febrile seizure，FS或febrile convulsion，FC）是婴幼儿期最常见的惊厥性疾病，其定义为发生在婴幼儿期的伴有发热的惊厥发作，并排除中枢神经系统及曾有无热惊厥病史者。本病的临床经过有多样性，可分为单纯热性惊厥（simple febrile seizure，SFS）和复杂热性惊厥（complex febrile seizure，CFS）两型。其中CFS的发病年龄＜6个月或在6岁以上仍发病，起病时体温可不足38℃，发作形式有部分性发作表现，起病24h内可复发1次或多次，惊厥时间较长，有的可达20min～30min，发作前可能已有中枢神经系统异常（如：智力低下、脑损伤或脑发育不全等），热退后一周脑电图仍有异常等特征。CFS可由病毒感染、神经生物化学异常等引起，其病因和发病机制尚不完全清楚，可能是环境因素和遗传因素共同作用的结果。另外，热性惊厥发作的严重程度、再发的危险性以及热性惊厥与癫痫之间也存在着遗传上的联系。目前以不同种族和地区的家系进行基因定位得到的热性惊厥候选染色体区域已经有8q13－21（FEB1）［1］、19p13.3（FEB2）［2］、2q23－24（FEB3）［3］、5q14－15（FEB4）［4］和6q22－24（FEB5）［5］等。而确切与热性惊厥相关的基因尚未找到，对于遗传基因的研究也大多集中于已知与其他癫痫有关基因的研究。目前已发现配体门控氯离子通道GAGAA受体γ2亚基基因（GABRG2）和电压门控钠离子通道α1、α2、β1亚基基因（SCN1A、SCN2A、SCN1B）的基因突变与CFS有关［6］。其中以GABRG2基因突变导致复杂热性惊厥最常见。为分析GABRG2基因的突变特点，现将2例CFS患儿的临床特点和GABRG2基因分析报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 病例［1］ 男，4岁。在3个月时有热性惊厥发作，表现为双眼上翻凝视、面色青紫、牙关紧闭、口吐白沫、口角及四肢不由自主地抽动、大小便失禁。抽搐时间约2min后，自行停止，神志恢复快，清醒后感乏力。此后一年内有2次热性惊厥发作，发作时体温均不足38℃，发作持续时间延长（＞15 min），3岁时出现一次无热惊厥发作，表现为双眼上翻、面色苍白、呼吸急促、口角及四肢抽搐，无大小便失禁。实验室检查脑电图（electroencephalogram，EEG）显示背景波正常，发作时可见顶／颞区棘－慢波，发作间歇期EEG正常，以后发作间歇期慢波明显增多，随着年龄的增长日渐活跃并显示频发的不规则棘波，核磁（Magnetic－resonance imaging，MRI）脑扫描显示正常。在发育过程中早期的行为发育正常，但语言发育延迟。脑脊液检查正常，血生化、血钙、血糖、血电解质、尿素氮、氨基酸检查均无异常改变。

病例［2］ 男，3岁。在8个月时出现首次热性惊厥发作，表现为口周发绀，呼吸急促，上肢不自主的抽动，下肢伸直，强直抽搐，伴呼之不应。2岁时出现两次热性惊厥发作，间隔不足24 h，发作时体温不足38℃，表现与第一次发作相同，持续时间约20min，伴大小便失禁，神志恢复时间长，但没有以癫痫持续状态为特征时出现的惊厥发作、失神性发作、肌阵挛、迟缓性发作。实验室检查EEG显示背景波正常，呈儿童异常睡眠EEG。MRI脑扫描显示正常，脑脊液检查正常，血生化、血钙、血糖、血电解质、尿素氮、氨基酸检查均正常。

1.2 研究方法

1.2.1 血标本的采集和基因组DNA提取 经实验对象的书面同意并签订知情同意书后，取2例患者的外周静脉血5mL，10%草酸钾抗凝，高盐法提取白细胞基因组DNA。

1.2.2 引物选择与合成 GABRG2的9个外显子序列（NT－023133）及cDNA 序列（NM－000816）由http：／／www.genatlas.org／获得，按参考文献［7，8］应用的引物序列设计引物，所有引物均设计在内含子或非翻译区，其扩增产物包括5’非翻译区和所有外显子，并包括各个外显子两端大约20个～30个碱基的内含子。引物委托北京诺赛基因组研究中心有限责任公司合成。

1.2.3 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 对GABRG2基因的9个外显子进行PCR扩增，反应体系是25 μL，包括10×Taq buffer2.5μL、25mmol／L MgCl21.5μL、2.5 mmol／L dNTP 2μL、5pmol／μL正反向引物各2μL、Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司）1.25U、基因组DNA 1μL、加去离子水至25μL体积。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火58℃～64℃30s，退火温度由具体引物决定，72℃延伸45s，共30个循环，72℃延伸10min。4℃保存。取3μL的PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定其扩增结果。

1.2.4 PCR产物直接测序 以PCR引物作为测序引物，委托北京诺赛基因组研究中心有限责任公司，用末端终止法在ABI9700型热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物在ABI PRISM3730型XLDNA序列分析仪上进行分析。对测序异常的片段重新进行PCR扩增，再次正向、反向测序，共3次，以验证结果的可靠性。测序结果应用DNAStar软件包中的SeqmanTM软件及EditSeq软件（Lasergene公司产品）与正常GABRG2全基因组序列（GenBank accession no.NT－013133）进行比对分析，并用http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov数据库验证。

2 结 果

2.1 PCR扩增 GABRG2基因9个外显子PCR扩增片段与预计的大小一致，没有非特异性扩增带。

2.2 DNA测序 根据人类DNA序列变异命名建议和美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的 GeneBank数据库资料（NM－000816）命名GABRG2基因变异。对2例CFS的患者的GABRG2基因全部9个外显子及其周围部分内含子进行检测，在第9外显子处检测出1个致病基因突变：1287G＞A，遗传密码子TGG被替换为终止密码子TGA，这一无义突变使390位的色氨酸残基被终止密码替换 （W390X）。这一基因突变在HGMD中已公布。

3 讨 论

热性惊厥是婴幼儿期最常见的惊厥性疾病，发病率2%～5%［9］。患儿预后一般良好，但约3%的患儿以后发展为无热惊厥，即癫痫［10］。CFS是婴幼儿期热性惊厥的复杂形式，主要诊断条件有：①24h内多次复发；②发作持续＞15min；③发作形式呈部分性发作者。热性惊厥附加症（febrile seizure plus，FS＋）是一个新提出的热性惊厥类型，其诊断标准是：在热性惊厥发展为典型癫痫之前，有2次以上的无热惊厥发作，或在6岁以后仍有热性惊厥者，称为热性惊厥附加症。Scheffer等［11］在1997年对澳大利亚一个热性惊厥表型的家系的受累成员的临床表型进行系统分析后，首先在国际上提出全面癫痫伴热性惊厥附加症（generalized epilepsy with febrile seizure plus，GEFS＋）的概念。其常见的表型是FS、FS＋，其他表型包括FS＋伴失神、FS＋伴肌阵挛或失张力发作，呈常染色体显性遗传伴外显率不全，其外显率为62%～76%［12］，有明显的表型异质性（同一基因突变有不同的临床表型）。目前认为FS＋和GEFS＋是同一基因的不同表现，其基因位于染色体19q13.1或2q21－q33，该基因与热性惊厥候选染色体基因座FEB2和FEB3部分重合。

热性惊厥的病因尚不完全明确，近年来研究发现，本病有明显的遗传倾向。其遗传机制较复杂，可能为常染色体显性遗传，也有隐性遗传和多基因遗传的报道，伴年龄相关的不完全外显性及表现度。有明显的遗传异质性（多基因遗传，单基因遗传均可见于FS）和基因座异质性（有几个基因位点都引起相同的FS表型）。

GABAA受体主要介导中枢神经系统突触传递的快速抑制，对抑制性突触后电流对大脑神经元的兴奋起抑制作用［11］，由α1－6、β1－3、γ1－3、δ、ε、π、ρ1－3几个不同的亚基组成，而α1、β2、γ2是 GABAA 受体的主要亚型［13］。其中 GABRG2基因定位于5号染色体的长臂上（5q34）［14，15］，全长85.70kb，由9个外显子和8个内含子组成，编码GABAA受体的γ2亚基，主要参与受体的运输、聚集及突触的保护。目前发现的GABRG2基因热点突变有7种，其中有3种错义突变：R43Q［16］、K289M［17］、R139G［18］；3 种 无 义 突 变：Q351X［19］、W390X［7］、Q40X［20］；1 种剪切位点的突变：IVS6＋2T＞G［21］，均为单基因并呈常染色体显性遗传伴外显率不全。其中W390X、Q351X突变位于3、4结构域之间的细胞内环，在翻译时过早的引入一终止密码子，使成熟的GABA受体蛋白失去了第四跨膜区，这种截短的GABA受体使细胞膜表面的受体密度下降，与GABA的结合下降，从而减弱了对神经元兴奋性的抑制，增加神经元的兴奋性和放电，增强突触对兴奋性传入的反应［22］。Sun等［8］对一GEFS＋家系进行研究发现，该家系先证者的GABRG2基因存在第9外显子的杂合无义突变1287G＞A（W390X），先证者之母和具有GEFS＋表型的其他家系成员均携带该基因突变，3代共有7例受累成员，临床表型1例为FS，6例为FS＋，1例携带该突变的家系成员临床表型正常，外显率约为87.5%，家系符合常染色体显性遗传伴外显率不全。Harkin等［23］对一GEFS＋大家系进行研究，先证者为SMEI，家系中有FS表型9例，FS＋表型1例。先证者及其父母亲均有GABGG2基因的Q352X突变，而2例受累者无此突变，进一步说明GEFS＋家系成员携带同一基因突变但表型轻重可以不同，其表型还受其他遗传因素和环境因素的影响。R43Q突变改变了第1、2跨膜区胞外段的高度保守的氨基酸残基区域（与苯二氮卓类结合的区域），减少细胞膜表面受体的表达，并影响其运输［23］和与大脑皮层兴奋性有关的苯二氮卓类的结合力［24］。Wallace等［16］首先在一热性惊厥家系中报道了R43Q突变，其先证者表型是特发性全身癫痫综合征（IGES），而一些无症状携带者也可在一些上一代中发现R82Q的突变，同时，在这一家系中有EEG异常或惊厥发作的病人未见R82Q的突变，这说明R43Q突变外显率不全及在一些个体中可能有另外一些因素参与从而抑制了惊厥的发作。K289M突变改变了第2和第3跨膜区之间胞外段的一高度氨基酸保守区域，降低GABA受体电活动的幅度［25］。R139G是跨膜区域胞外段与热性惊厥有关的一错义突变，这一突变增加了受体的脱敏作用并降低了对地西泮的敏感性［18］。IVS6＋2T＞G，这种GABAA受体突变的作用尚不完全清楚，但认为由于外显子的跳跃导致编码蛋白的功能丧失这是由于他在第5外显子和第7外显子连接位置过早出现终止密码子［26］，使受体功能障碍，抑制功能不足，可能与导致CFS易感性有关。

对本研究中的2例CFS儿童进行研究，采用PCR扩增GABRG2基因9个外显子及其周围的部分内含子，用正反向引物对PCR产物进行直接DNA序列测定，结果在2例CFS儿童中均发现GABRG2基因第9外显子第1287位G＞A，使第390位的色氨酸（Trp，W）残基被终止密码替换（W390X），这与已发现的突变热点相一致，提示GABRG2基因突变是CFS儿童的主要致病原因。对两位患者的父母亲进行突变基因筛查，发现在第一位患者父亲有相同的突变位点但未发病，这说明W390X突变有不同的外显率［8，12］，与国内外报道相一致。而在母亲未发现相同的突变。在第二位患者母亲发现突变，曾有热性惊厥史，未对其弟弟进行突变基因筛查。以上证据表明，GABRG2基因突变可导致CFS疾病的发生。

总之，本研究在2例CFS患儿中检测到GABRG2基因1个致病突变（W390X），提示GABRG2基因突变是本研究2例CFS儿童的主要致病原因。

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