角膜缘干细胞功能障碍的治疗进展

林志荣 刘祖国

1971年，Davanger和Evensen[1]观察到在中央角膜上皮创伤愈合过程中存在由角膜缘往角膜中央移动的色素性上皮细胞线，据此首次提出了角膜缘是角膜上皮细胞更新来源的假设。此后，大量实验证据均证实角膜上皮干细胞存在于角膜缘，包括上皮向心性迁移，角膜缘处干细胞标志物的发现等。目前，角膜缘干细胞和存在及基本作用已被公认。角膜缘是位于角膜与巩膜交界处，宽约1mm的特殊区域，裂隙灯下可见垂直角膜边缘的含色素嵴状隆起，上下方角膜缘处尤甚。角膜缘处的上皮细胞层数达10～12层，排列不规则，深层基底部细胞为一层小圆柱状或立方形细胞，与基底膜紧密相贴，核浆比大，胞核呈卵圆形。此处的基底膜向下突起，形成非均一的乳头样上皮结构，即Vogt栅栏。角膜缘干细胞即位于Vogt栅栏的基底层。Vogt栅栏中的基底膜、血管、神经、黑色素细胞、间充质细胞，以及其他与角膜缘干细胞间接或直接作用的成分和细胞因子等，共同构成了角膜缘干细胞的基质微环境（microenvironment）。角膜缘干细胞（limbal stem cells，LSCs）属单能干细胞，其分化水平低，细胞周期长，拥有无限自我更新能力，在特定应激状态下可高度增殖，这些特性的维持高度依赖于正常微环境成分的保护和调控。LSCs定向分化产生一定数量可快速分裂的前体细胞，又称过渡放大细胞（transient amplifying cells，TACs）。TACs在向角膜中央移行的同时分裂为终末分化角膜上皮细胞，形成复层化角膜上皮，处于最表层的上皮细胞则逐渐凋亡脱落。此种上皮更新是维持角膜透明性及正常视功能的基础[2]。

各种原因造成角膜缘干细胞损伤或是基质微环境异常时产生的病理状态称为角膜缘干细胞功能障碍（limbal stem cell deficiency，LSCD），以角膜上皮结膜化为主要特征。LSCD实际上包括一大类疾病，可分为原发性及继发性。原发性LSCD多为角膜缘发育异常，如先天性无虹膜症，先天性皮肤红色角化症；继发性LSCD临床多见，为物理化学因素或自身免疫异常引起的角膜缘干细胞和微环境破坏，如机械损伤、化学烧伤和Stevens Johnson综合征等。缺损的角膜缘干细胞及微环境无法维持正常的角膜上皮更替，造成持续反复的上皮愈合不良，继而引起基质炎症甚至溃疡穿孔，最终产生角膜新生血管和上皮结膜化。其中，角膜上皮结膜化是诊断LSCD的最特异指标，裂隙灯下表现为角膜出现表浅或深层新生血管及纤维血管翳，荧光素呈点状着染，有时可见角膜缘嵴状突起的减少或消失。活体角膜上皮结膜化的确定目前依赖于印迹细胞学或局部活检，通过特定标志物检测杯状细胞或结膜上皮细胞[3]。近年来活体激光共聚焦显微镜[4]及眼前节光学相干断层扫描技术[5]等无创、快速的方法也逐渐应用于LSCD的诊断，显示了良好的应用前景。

正确的诊断及对角膜缘受累范围、缺损程度的准确评估是制定LSCD治疗策略的基础。局部性LSCD与全周性LSCD，单眼LSCD与双眼LSCD的治疗策略显然不同。然而，许多临床上诊断为LSCD的患者，其印迹细胞检查杯状细胞并不一定呈阳性。这种情况常见于某些严重的化学伤，瘢痕性类天疱疮或Stevens Johnson综合征的患者[6]。故LSCD的准确诊断实际上面临一定的困难，尤其是在尝试利用无创检查的情况下。有学者提出可寻找特征性更好的LSCD阳性指标等设想，但未见报道。另外，印迹细胞学的结果无法反映干细胞受损程度，对制定治疗策略的指导意义有限。因此，目前国内对LSCD的诊断及处理仍基于其临床特点，LSCD的预防、诊断及有效治疗仍是眼科临床工作中的棘手问题之一。

长期以来，LSCD的治疗效果很不理想，目前仍无针对LSCD的有效治疗药物，手术仍是治疗角膜缘干细胞功能障碍的惟一手段。自1989年Kenyon等[7]首次应用角膜缘组织移植治疗LSCD以来，许多学者对移植的方式和效果进行了大量研究及改良，使这类疾病的预后有了明显改善。这些术式[8]按手术治疗的作用对象可分为恢复干细胞基质微环境和角膜缘干细胞移植两大类。

一、恢复干细胞基质微环境

干细胞基质微环境是维持干细胞功能的基础。相当一部分患者的角膜缘干细胞本身并无损害，而基质微环境在各种因素影响下发生功能障碍。当此种功能障碍较轻时，可行手术改善或恢复基质微环境。目前常用的手术方式为角膜表层清创联合羊膜移植术。实际上，单纯角膜表层清创后，少数病例可恢复正常的角膜上皮更新，若联合羊膜移植则预后更佳。该术式多应用于局限性LSCD。尽管羊膜移植并不直接提供健康干细胞，但它可减轻急性期炎症从而降低LSCD的发生机率，且可通过羊膜中的各种活性成份促进角膜缘残留干细胞功能的恢复，故可扭转一部分的局限性LSCD。Anderson等[9]对17只局限性LSCD患眼进行了角膜表层清创联合羊膜移植，平均随访26个月；Kheirkhah等[10]对11只不同受累程度的LSCD患眼施行表层角膜切除术后，再进行无缝线羊膜移植术，平均随访14个月。两项研究中所有患眼均获得了光滑稳定的角膜上皮面，角膜原有混浊及新生血管明显减轻，大部分病例视力提高。少数大范围LSCD的患者经分阶段手术切除不同部位的角膜血管翳并移植羊膜，亦获得了良好的角膜透明度。尽管目前仍不清楚何种范围及程度内的LSCD可被此类手术逆转，但这些结果至少说明，某些局限性LSCD不一定需要进行干细胞移植，患眼残存的干细胞可能在某些条件下被重新激活继续发挥功能。

二、角膜缘干细胞移植术

(一)自体角膜缘干细胞移植

植片由结膜瓣及对应角膜缘组成，故又称为结膜角膜缘移植（conjunctival limbal autograft，CLAU）。CLAU主要用于单眼LSCD患者，如化学伤，部分翼状胬肉等，是治疗LSCD的首选术式。由于是从自体对侧眼取材，移植后不存在免疫排斥，植片的长期成活率很高，且较异体植片能更好地恢复干细胞功能及角膜透明度[11]。但长期以来，取材范围的大小一直未能获得共识。多大范围的植片既能有效恢复术眼的角膜缘活力，又不会破坏取材眼的正常功能。最早的CLAU采用鼻、颞侧角膜缘各120°的取材范围。由于取材范围较大，供眼易发生如上皮下混浊、假性胬肉、丝状角膜炎甚至角膜缘功能进行性衰竭等并发症。迄今已有若干临床报告[12-13]分析了不同范围植片CLAU及是否联合羊膜移植的效果，平均移植成功率超过80﹪。目前认为，180°范围以内的取材不会影响供眼的正常角膜缘功能，而小于90°的植片将使术眼移植成功率明显下降。Kheirkhah等[14]报道对一例完全性LSCD患眼施行60°范围植片的CLAU联合羊膜移植术，术眼的角膜缘功能亦得到恢复，矫正视力由0.05提高到0.2，这是目前报道的最小有效植片。实际上，由于人眼角膜缘干细胞的密度及功能状态在角膜缘的不同部位存在一定差异，故移植相同范围的鼻颞侧角膜缘来源的植片与上下方来源植片的预后可能有所不同。Sangwan等[15]则报道将取材范围缩小至角膜缘2 mm×2 mm范围的板层，并将该板层剪为8～10个碎片，将碎片均匀种植于羊膜上后再覆盖在角膜表面的技术。此种技术简单易于操作，术后疗效较为满意。

自体角膜缘干细胞移植已逐渐成为较可靠且成熟的治疗方式，但对于取材眼实为亚临床状态的患者，则CLAU可能造成亚健康眼角膜缘功能的下降甚至衰竭。因此，必须重视术前对取材眼角膜缘的评估。患眼的活动性炎症可能会降低CLAU的成功率，术前应尽量控制炎症或待炎症稳定后手术。

(二)异体角膜缘干细胞移植

对于双眼患病及其他各种无法提供自体健康角膜缘组织的LSCD病例，只能进行异体角膜缘干细胞移植。按植片的特点，可分为以下几种。

1.活体亲属的结膜角膜缘移植（living-related conjunctival limbal allograft，lr-CLAL）：lr-CLAL的植片构成与CLAU相同。植片取材于活体亲属角膜缘，因供受体HLA抗原较接近，排斥反应的机率相对较低，但仍需一定的免疫抑制剂支持。Wylegala等[16]回顾分析了26只行lr-CLAL的患眼，发现lr-CLAL的成功率总体略低于CLAU而高于非活体亲属来源的异体植片移植，随访6年后，其中14只患眼获得一定的视力提高，7眼发生排斥。对lr-CLAL而言，供受体HLA匹配程度越高，其成功率越高。但即使HLA配型相符，仍可能存在移植失败。

2.环形异体角膜缘移植（keratolimbal allograft，KLAL）：植片为360°环状板层，由小部分巩膜、全周角膜缘以及极周边透明角膜部分组成，不包括结膜。KLAL可提供最充足的干细胞支持，术后早期成功率与CLAU相当。目前KLAL多联合羊膜移植术，并加用局部或全身免疫抑制剂。KLAL术后并发症相对CLAU较多，主要是免疫排斥、青光眼等[17]。随着随访时间的延长，中远期移植成功率逐渐下降，主要原因仍是免疫排斥反应[16]。即使长期系统应用环孢素A、他克莫司等免疫抑制剂，KLAL的远期预后仍不够理想。免疫排斥并不是使KLAL远期成功率下降的惟一因素，严重的干眼、慢性炎症、眼睑及睑缘的异常、高眼压状态等均可影响KLAL的预后[18]，故术前须对患眼进行详细评估，在术前或术后进行合理的药物控制，如应用人工泪液及抗炎药物等。此外，KLAL对一些特殊病例甚至无效。先天性无虹膜症虽为KLAL的适应证，但有报道发现手术治疗与保守治疗的最佳矫正视力远期结果却无统计差异[19]，可能因为先天性无虹膜症者多合并其他眼内异常，进行角膜缘移植术后易出现的高眼压、脉络膜脱离和玻璃体积血等，极大影响了视力。

对于需要眼表重建的LSCD病例，常进行KLAL联合穿透性角膜移植（penetrating keratoplasty，PK）手术，但手术的时机存在争议。部分学者[20]认为，由于PK术的成功与正常的上皮更新、稳定的泪膜等关系密切，若不先恢复角膜缘功能，则持续上皮缺损等将使PK术成功率明显下降，即应先进行KLAL，再二期进行PK术。另一部分学者[21]认为，由于分期手术中使用的角膜缘植片和角膜植片往往来源于不同供体，总体排斥机率明显上升，且二期PK术后往往可诱使角膜缘植片发生排斥，故应进行同期联合手术。目前对手术时机的选择标准尚需更多临床研究数据的支持。史伟云等[22]回顾分析了进行了KLAL同时联合PK术的23只严重碱烧伤患眼数据，随访2年后约65﹪的患眼视力获得一定提高，而48﹪的患眼则发生了不同程度的排斥。尽管低于国外报道的排斥率，但KLAL的总体排斥率仍然较高，并发症较多。

3.带巩膜大植片穿透性角膜移植（corneoscleral transplantation，CST）：植片由全角膜、全周角膜缘及一定宽度的全层巩膜组成。在某些眼表大范围严重感染或融解时，角膜及角膜缘均受累及，角膜往往融解或变薄，单纯进行角膜缘干细胞移植或穿透性角膜移植无法解决问题。此时，可应用CST进行治疗。植片巩膜部直接缝合于近角膜缘的巩膜植床表面。此种手术虽然提供了完整的角膜和角膜缘组织，但其排斥机率很高，程度重且发生快，对免疫抑制剂不敏感，故成功率远不及KLAL及CLAU。史伟云等[22-23]报道发生排斥的时间多为术后2周至1月，免疫排斥反应可累及植片及睫状体等部位，造成明显视力下降、后弹力层褶皱、角膜缘组织充血、低眼压和浅前房等表现。相对而言，KLAL联合PK术并发症较少，预后较好。

4.带角膜缘大植片板层角膜移植（largediameter lamellar keratoplasty，LDLK）：植片为角膜和角膜缘的前板层。当发生LSCD且角膜部深基质未受累时，如某些碱烧伤、蚕食性角膜溃疡等，可进行带角膜缘的板层角膜移植术，又称全板层角膜移植术。2000年，Vajpayee等[24]对9只严重化学伤的患眼进行了LDLK，平均随访6个月，患者的症状、上皮修复、矫正视力及泪膜状态等均得到一定改善，且无一例发生复发新生血管或植片排斥,但无更长时间随访数据。后续的许多报道均显示了LDLK的优越性[25]。对于一些大范围眼表浅层损伤，包括累及角膜1/2面积以上的蚕食性角膜溃疡等，LDLK显示了良好的治疗效果。由于LDLK术未涉及内皮，且为一次手术，故与KLAL联合PK术等相比，排斥机率明显降低。临床报道眼表重建效果较好，术后并发症多为免疫排斥及角膜基质层混浊。

(三)体外扩增角膜缘上皮细胞移植（ex vivo cultured limbal epithelial transplantation，CLET）

1997年Pellegrini等[26]首次报道在2例单眼碱烧伤患者的角膜表面接种体外培养的自体角膜缘上皮细胞，揭开了体外扩增上皮细胞移植的序幕。它是一类从自体对侧健眼，活体亲属眼或新鲜尸眼的健康角膜缘上皮部取材，将获得的含干细胞组织块在实验室条件下直接培养或进行单细胞分离与扩增，使干细胞生长于特定载体上，最后与载体一起回植于患眼受损角膜缘的新兴技术。由于取材的组织中真正干细胞的含量仅为极少数，其余大部分细胞为分化程度较高的前体细胞和上皮细胞，故严格而言，此种治疗方法应称为体外扩增角膜缘上皮细胞移植，但目前尚有学者沿用“体外扩增角膜缘干细胞移植”的表述。与传统移植相比，CLET具有明显的优势，如所需角膜缘组织范围小（2 mm×2 mm）不致影响供眼的角膜缘干细胞功能，来源灵活并可多次取材等，极大缓解了角膜缘移植手术供体来源匮乏的矛盾；扩增的细胞植片中不含朗格汉斯细胞及树突状细胞等抗原呈递细胞，植片发生免疫排斥反应的风险大大降低。但同时有费用相对昂贵和细胞植片长期转归仍不明确等问题。近年亦有体外扩增结膜上皮细胞[27]、口腔黏膜上皮甚至毛囊细胞[28]等非角膜缘来源者用于全周LSCD治疗的报道，为CLET开辟了更广阔的供体组织来源。

理论上讲，CLET适用于各种全周或局部LSCD，以及一些角膜缘较大范围切除后（如角膜缘肿瘤切除等）。但在一些较特殊的局部干细胞功能障碍患者中，若其他治疗方式疗效已足够好，则CLET不作为首选术式。例如，翼状胬肉患者应用单纯的自体结膜移植的有效率已达79﹪～96﹪；一些局部LSCD患者，应用SECT或羊膜移植有逆转可能，上述情况下应用CLET并不能提高疗效，还增加了治疗成本。目前，CLET多应用于物理化学损伤所致全周LSCD，Stevens Johnson综合征及眼瘢痕性类天疱疮等。其中以全周LSCD的治疗成功率最高。但目前尚无大样本的随机对照临床实验研究CLET与传统角膜缘移植术在疗效方面的优劣。

体外扩增干细胞的质量与供体眼角膜缘有关，活体来源角膜缘组织块的体外增殖能力要好于尸眼来源[29]。另外，由于干细胞的存活及功能发挥需要基质微环境的调控，故角膜缘干细胞的体外扩增需要一定的载体提供类似支持。组织块法培养的干细胞载体目前主要包括3T3成纤维细胞层、羊膜，或是二者的综合。若通过单个悬浮细胞培养扩增，则除了上述几种载体，还包括各种特殊载体材料，如纤维蛋白膜和交联胶原蛋白等，部分特殊材料的效果可与羊膜载体相当[30]。羊膜及3T3细胞均能促进有效干细胞的增殖并维持其“干性”(stemness)，3T3细胞与去上皮羊膜联合使用，能使扩增细胞的ABCG2、p63等干细胞标志物持续表达时间明显延长[31]。羊膜易于获得，一定时间后可自动降解，厚度适中，是目前应用最广泛的载体。但不同的羊膜预处理方法对其扩增性能有一定影响，深低温保存的羊膜可能使干细胞发生形态及表型异常[32]。在干细胞扩增完成后，移植的手术方法多为将干细胞-载体复合体以细胞面朝向泪膜的方式缝合至已切除结膜血管翳的角膜缘基质处，或是将扩增的无载体复层上皮片以基底细胞朝向角膜基质面的方式直接放置于相同位置而不使用缝线。另外，将植片按特定大小形态切割，可移植于特定角度受累的不完全性LSCD患眼。

组织块培养扩增后的细胞群是否是真正意义上的角膜缘干细胞一直存在争议。绝大多数研究报道指出[33]，扩增后的表层细胞群表达了上皮的分化标志物角蛋白3和12，而基底部细胞则是角蛋白3阴性，角蛋白19、整合素及p63等干细胞标志物阳性。这说明扩增后的基底部细胞多为干细胞而非角膜上皮表型。然而，正常组织中的干细胞仅占2﹪～9﹪，扩增细胞群中干细胞比例理论上应较低，故上述研究中的基底部细胞很可能不全是干细胞。尽管ABCG2及p63作为较特异的干细胞标志物逐渐被广泛应用，但在目前仍无干细胞绝对标志物的情况下，对扩增细胞群进行准确的细胞表型鉴定存在困难。Kolli等[34]发现，在以羊膜为载体的干细胞组织块培养后，离原始组织块越远的扩增细胞，ABCG2、p63的表达越弱，而分化标志物CK3的表达越强。在同一块植片上，不同位置的细胞分化程度不一致，若将分化程度较高的细胞群用于移植手术中，有可能影响疾病转归。

尽管存在各种争议，体外扩增干细胞移植术的效果却是明确的。术后长期随访均显示角膜上皮层角蛋白表达正常且无杯状细胞。然而，移植的干细胞是否长期存活，角膜上皮的正常恢复是否全部源于外来的干细胞植片却并不清楚。Daya等[35]对10只进行扩增干细胞移植且LSCD成功缓解的患眼进行了眼表细胞基因来源分析，发现平均随访9个月后，检测到的角膜表面细胞DNA均与受体本身DNA吻合，提示修复的角膜上皮层几乎来自受体本身而非植片上的干细胞。这说明扩增干细胞移植的中长期作用机制可能不是直接提供干细胞，而是通过提供较健康的龛环境，使得受体本身的干细胞数量与功能逐渐得到恢复。

上述各种移植术式各有优缺点和适应证。由于各报道中LSCD病例的特点有所不同，如供体角膜缘的质量，LSCD的原发病因，植床的炎症或免疫状态，具体术式及合并术式，既往手术史以及随访时间等，给合理分析带来了困难。从这个角度讲，目前多数相关报道均有相应的局限性。但不可否认的是近20年来关于角膜缘干细胞移植的研究已经取得了众多成果并仍在继续深入。在中国，由于供体眼球来源相对匮乏，体外扩增角膜缘干细胞移植则显示了良好的应用前景。

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