RASSF1A抑癌基因在肿瘤中的研究进展

陈谭根，李建国

2000年，Dammann等［1］利用酵母菌双杂交法从肺癌细胞株3号染色体短臂筛选出一种互补DNA，其编码的蛋白质能与DNA修复蛋白XPA相互作用。因其核苷酸序列的羧基末端与小鼠RAS效应蛋白Nore1高度同源，遂命名为RAS相关区域家族1(RAS association domain family 1，RASSF1)。已有研究表明，其亚型RASSF1A基因的失活在多种人类肿瘤的发生发展过程中起重要作用，本文就RASSF1A基因与肿瘤的研究进展进行综述。

1 RASSF1A基因的定位和结构特点

RAS相关区域家族包含10个成员(RASSF1-10)［2］，RASSF1 基因位于人染色体 3p21.3 上，全长11 kb。由于选择性剪切和不同启动子的使用，RASSF1基因至少存在8种不同的转录本(RASSF1A-H)。其中RASSF1A和RASSF1C为两个主要的亚型，由两个相距3.5 kb的不同CpG岛启动子转录产生，含有4个共同的外显子(3，4，5，6)，几乎表达于所有的正常组织中。RASSF1A的cDNA 全长1 968 bp，包含6个外显子(1α，2αβ，3，4，5，6)，编码产物为含340个氨基酸残基的蛋白质，相对分子量为 39 kDa［3］。目前研究 发 现RASSF1A蛋白含有5个结构域:(1)RAS相关结构域，RASSF1A通过其RAS结构域与RAS-GTP结合，调节RAS介导的RAS/RAF/ERK信号转导通路［4］;(2)SARAH结构域，介导蛋白质的相互作用，在诱导细胞周期停滞和凋亡的通路中起关键作用［5］;(3)ATM(ataxia telangiectasia mutated)磷酸化位点，参与维持基因组的稳定性［6］;(4)C1/DAG结合域，也称为蛋白激酶C保守区域1(protein kinase C conserved region 1，PKCC1)，参与调节微管系统，维持基因组稳定［7］;(5)SH3 结合结构域［8］，具体作用机制还有待研究。

2 RASSF1A主要生物学功能与机制

研究表明，RASSF1A的过表达能够促进细胞凋亡、细胞周期停滞和降低肿瘤细胞株的致瘤性［9］。作为骨架蛋白，组装和调节多个效应蛋白复合物相互作用。RNA干扰(RNAi)实验提示RASSF1A基因表达下调可使细胞周期调控缺失，增强遗传不稳定性及细胞活力，还可以对抗K-RAS和TNF-α所诱导的细胞凋亡［10］。RASSF1A参与调节多种生物学过程，作用机制复杂，现分述如下。

2.1 RASSF1A调节微管维持基因组稳定 有丝分裂过程中，染色体的正确分离直接取决于有效运转的微管网络。微管是在聚合和解聚两种状态下不断转换的聚合物。微管动力是由微管结合蛋白(MAPs)直接结合微管蛋白调节的，MAPs的主要作用是保护微管的稳定性，避免解聚和介导微管与其他细胞成分之间的相互作用。MAPs含3种蛋白质:MAP1b，C19ORF5(chromosome 19 open reading frames 5)和MAP4。其中MAP1b和C19ORF5增强微管聚合，而MAP4阻碍微管解聚。RASSF1A可能通过MAPs与微管相关联。RASSF1A蛋白在分裂间期分布在细胞质微管中，在分裂前期分布于中心体，在有丝分裂中期和后期分布于纺锤体微管和纺锤体极，在末期分布于中间体。RASSF1A与微管蛋白结合，促进微管稳定及调节有丝分裂过程［11］。纺锤体调节的缺失可导致基因组不稳定性，而基因组不稳定性是变异细胞的标志之一。由于RASSF1A基因分布于中心体和纺锤体，调节微管蛋白的动力学，故 RASSF1A与维持基因组的稳定性相关。RASSF1A的细胞器分布还与 C19ORF5有关。C19ORF5是一种超稳定的特殊微管结合蛋白，与RASSF1A基因表达下调相似，通过 RNAi抑制C19ORF5表达同样可导致基因组不稳定。C19ORF5可提高RASSF1A稳定有丝分裂细胞周期蛋白的能力。RASSF1A含ATM激酶磷酸化位点，而ATM具有参与DNA损伤检查点的功能。研究发现，人类肿瘤中存在点突变导致RASSF1A的ATM位点损伤［12］。尽管目前很难明确ATM点突变和野生型的RASSF1A调节微管稳定性有无区别，但有学者认为RASSF1A调节基因组稳定性可能与ATM有关［13］。

2.2 RASSF1A调节细胞周期 RASSF1A可调节Rb家族进入S期的细胞周期限制点，诱导细胞周期停滞。RASSF1A在肺癌和乳腺癌细胞系(NCIH1299和HME50-hTERT)的过表达可抑制细胞周期蛋白D1(cyclin D1)蓄积(通过抑制mRNA翻译)，导致细胞生长停滞。这种现象可被异位表达cyclin D1或者G1/S期的其他下游活化分子(如cyclin A和 E7)而逆转。Agathanggelou等［14］研究发现，RASSF1A可诱导非小细胞肺癌(NSCLC)细胞G1周期停滞，并伴有cyclin D1表达水平下调。通过酵母双杂交筛选，p120E4F已被确定为RASSF1A相互协同作用分子之一，p120E4F抑制cyclinA2的转录，协同RASSF1A诱导 G1-S期停滞［15］;而 RASSF1A 也协同p120E4F抑制cyclinA2。敲除乳腺癌HB2细胞系的内源性RASSF1A，p120E4F与cyclinA2启动子的结合则明显减少;在稳定表达RASSF1A的肺癌A549细胞系中，p120E4F与cyclinA2的结合显著增强［16］。cyclinA2是RASSF1A与 p120E4F共同作用的细胞靶点，从而控制S期进程，由此推测细胞周期调控存在RASSF1A依赖的转录调控机制。RASSF1A还通过JNK通路促使G1期停滞。在稳定转染RASSF1A的肺癌H1299细胞中，JNK和cjun磷酸化降低，JNK活性受到抑制并伴有cyclin D1表达水平下调。RASSF1A还能通过其SARAH结构域直接作用于MST1激酶，调节JNK活性和阻断信号传递［17］。

2.3 RASSF1A与细胞凋亡 RASSF1A可能参与了多条不同的细胞凋亡途径。Baksh等［18］研究发现，RASSF1A是死亡受体诱导Bax构象改变和凋亡所必须的。在受体刺激后，RASSF1A和MOAP-1(modulator of apoptosis-1)募集和形成复合物于细胞膜，并解除MOAP-1的分子内抑制，使MOAP-1与BAX结合。凋亡效应蛋白 KRAX的活化能增强RASSF1A与 MOAP-1的结合，抑制细胞生长。因此，RASSF1A通过MOAP-1和活化的 KRAX调节BAX 活性，诱导细胞凋亡［10］。Foley 等［19］发现，在TNF-α刺激作用下，MOAP-1与TNF-R1(肿瘤坏死因子受体1)结合并募集RASSF1A成为复合物，参与死亡受体依赖的凋亡途径。RASSF1A与TNF-R1相互作用参与内体运输，通过影响微管网络稳定性调节TNF-R1内化。过表达RASSF1A能使乳腺癌MCF-7细胞(缺乏内源性RASSF1A)通过死亡受体依赖途径诱导凋亡［18］。而在人胚肾293T细胞，RASSF1A本身很少引起凋亡，但能显著增加CNK1(connector enhancer of KSR)诱导的细胞调亡。CNK1是活化RAS所必需的一种多位点支架蛋白，能与MST1和MST2相互作用诱导细胞死亡。敲除MST1羧基末端片段可调停MST1与RASSF1A的结合［20］。但必需指出的是，RASSF1A与凋亡通路有关的大部分数据都是基于RASSF1A过表达转染的研究，不一定能反映生理上的情况。

3 RASSF1A甲基化与肿瘤

在哺乳动物中，DNA甲基化作用(DNA methyla-tion)是指在 DNA甲基转移酶(DNA methyltransfeRASe，DNMT)的催化下，以 S-腺苷甲硫氨酸(SMA)提供甲基团，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基基团的化学修饰现象。通常发生在5'-胞嘧啶位置上，这种DNA修饰方式是一种重要的表观遗传机制，能够在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因表达和保护DNA位点不受特定限制酶降解的作用。基因突变、缺失和(或)DNA启动子异常甲基化均可能导致RASSF1A失活。研究认为，RASSF1A基因沉默的主要机制是启动子的异常甲基化。人类肿瘤中的RASSF1A表达缺失是一个普遍事件，至少在37种肿瘤中存在RASSF1A 启动子的异常甲基化［21-22］。Saelee 等［23］报道，86%的肝细胞癌存在RASSF1A甲基化，并与患者的预后和生存时间显著相关。Malpeli等［24］发现，80%(16/20)的胰腺癌组织存在RASSF1A甲基化，且其基因表达沉默与甲基化状态呈正相关。人类睾丸肿瘤中，RASSF1A基因78.75%的GC位点发生甲基化，且与基因抑制明显相关，而正常睾丸组织则很少发生甲基化［25］。通常RASSF1A甲基化频率在肿瘤细胞株要高于原发性肿瘤，这可能是由于在培养基中生长的肿瘤细胞重新发生甲基化。然而，用DNA甲基化转移酶抑制剂处理RASSF1A异常甲基化的肿瘤细胞株，可发现RASSF1A异常甲基化水平降低，并诱导RASSF1A基因的重新表达。

4 RASSF1A甲基化作为肿瘤生物标记的应用

RASSF1A过度甲基化可能成为一种肿瘤生物标记，具有潜在的临床应用前景。该基因在广泛的人类肿瘤中均发生中等到高频的甲基化，而正常组织几乎不发生。因此，RASSF1A甲基化被考虑作为肿瘤的早期检测和预后标记，预测良性增生物恶性转化的风险以及患者预后。

4.1 RASSF1A甲基化作为诊断标记物 目前已证实，肿瘤患者血清中来自肿瘤细胞释放的游离DNA含量升高，而RASSF1A甲基化作为肺癌诊断标记的研究最多。34%的NSCLC组织和血清中存在RASSF1A异常甲基化。在很大比例的吸烟者上消化道、支气管灌洗液、血浆和痰液中均检测到RASSF1A甲基化，且与吸烟者每年的吸烟数量相关［26］。将RASSF1A甲基化分析与细胞学和组织学等常规诊断方法相结合可提高诊断敏感性。例如，支气管抽取物RASSF1A甲基化、组织学的肺癌检测率分别仅为53%、59%，然而将检测方法结合，诊断敏感性提高到81%［26］。另外，也有RASSF1A甲基化作为乳腺癌、膀胱癌和肾癌等肿瘤诊断标记的报道。在乳腺癌患者中，65%的肿瘤组织存在RASSF1A甲基化，其相应的血清中有56%同时存在RASSF1A甲基化，而未检测到甲基化的肿瘤组织其血清中也未发生RASSF1A甲基化［27］。值得注意的是，在血清中检测RASSF1A甲基化未取得理想效果。Murray等［28］在65%霍奇金淋巴瘤中检测到RASSF1A甲基化，而相应的血清中仅有4%发生甲基化。这些研究结果表明，可以在肿瘤患者的一系列体液中检测到RASSF1A甲基化，与传统的诊断方法相比其敏感性有很大提高。因此，RASSF1A甲基化可成为一种有用的早期诊断标记，提供一种肿瘤诊断的新方法。

4.2 RASSF1A甲基化作为预后标记物 RASSF1A过度甲基化可能预示患者生存率降低，在血管和胸膜受累的NSCLC患者中，RASSF1A甲基化与肿瘤低分化和患者的低生存率有关［29］。RASSF1A甲基化与患者开始吸烟的年龄、早期肺癌的复发和低生存率有关［30］，但也有报道RASSF1A甲基化与患者的生存率无关［31］。RASSF1A甲基化在恶性肿瘤预后评估中的价值尚有待更进一步的研究。

5 问题与展望

现已证实，启动子高甲基化导致抑癌基因的表达沉默是人类肿瘤中抑癌基因失活的共同机制之一，并且可能成为一种有应用前景的体液分子检测新靶点。但目前RASSF1A甲基化研究尚处于探索阶段，RASSF1A基因表达调控机制、在肿瘤的发生发展中的作用以及RASSF1A启动子甲基化作为诊断早期肿瘤和判断预后的生物标记仍尚未完全阐明，仍需进一步研究。

［1］Dammann R，Li C，Yoon JH，et al.Epigenetic inactivation of RAS association domain family Protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3［J］.Nat Genet，2000，25(3):315-319.

［2］Richter AM，Pfeifer GP，Dammann RH.et al.The RASSF proteins in cancer;from epigenetic silencing to functional characterization［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2009，1796(2):114-128.

［3］Donninger H，Vos MD，Clark GJ.The RASSF1A tumor suppressor［J］.J Cell Sci，2007，120(Pt18):3163-3172.

［4］Thaler S，Hahnel PS，Schad A，et al.RASSF1A mediates p21Cip1/Waf1-dependent cell cycle arrest and senescence through modulation of the Raf-MEK-ERK pathway and inhibition of Akt［J］.Cancer Res，2009，69(5):1748-1757.

［5］Scheel H.Hofmann K.A novel interaction motif，SARAH，connects three classes of tumor suppressor［J］.Curr Biol，2003，13(23):R899-R900.

［6］Kim ST，Lim DS，Canman CE，et al.Substrate specificities and identification of putative substrates of ATM kinase family members［J］.J Biol Chem，1999，274(53):37538-37543.

［7］Newton AC.Protein kinase C.Seeing two domains［J］.Curr Biol，1995，5(9):973-976.

［8］Gordon H，Baksh S.RASSF1A Not a prototypical RAS effector［J］.Small GTPases，2011，2(3):148-157.

［9］Agathanggelou A，Cooper WN，Latif F.Role of the RAS-association domain family 1 tumor suppressor gene in human cancers［J］.Cancer Res，2005，65(12):3497-3508.

［10］Vos MD，Dallol A，Eckfeld K，et al.The RASSF1A tumor suppressor activates Bax via MOAP-1［J］.J Biol Chem，2006，281(8):4557-4563.

［11］Vos MD，Martinez A，Elam C，et al.A role for the RASSF1A tumor suppressor in the regulation of tubulin polymerization and genomic stability［J］.Cancer Res，2004，64(12):4244-4250.

［12］Shivakumar L，Minna J，Sakamaki T，et al.The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation［J］. MolCellBiol，2002，22(12):4309-4318.

［13］Levitt NC，Hickson ID.Caretaker tumour suppressor genes that defendgenome integrity［J］.Trends Mol Med，2002，8(4):179-186.

［14］Agathanggelou A，Bièche I，Ahmed-Choudhury J，et al.Identification of novel gene expression targets for the RAS association domain family 1(RASSF1A)tumor suppressor gene in non-small cell lung cancer and neuroblastoma［J］.Cancer Res，2003，63(17):5344-5351.

［15］Fenton SL，Dallol A，Agathanggelou A，et al.Identification of the E1A-regulated transcription factor p120E4F as an interacting partner of the RASSF1A candidate tumor suppressor gene［J］.Cancer Res，2004，64(1):102-107.

［16］Ahmed-Choudhury J.Agathanggelou A，Fenton SL，et al.Transcriptional regulation of cyclin A2 by RASSF1A through the enhanced binding of p120E4F to the cyclin A2 promoter［J］.Cancer Res，2005，65(7):2690-2697.

［17］Ura S，Nishina H，Gotoh Y，et al.Activation of the c-Jun N-terminal kinase pathway by MST1 is essential and sufficient for the induction of chromatin condensation during apoptosis［J］.Mol Cell Biol，2007，27(15):5514-5522.

［18］Baksh S，Tommasi S，Fenton S，et al.The tumor suppressor RASSF1A and MAP-1 link death receptor signaling to Bax conformational change and cell death［J］.Mol Cell，2005，18(6):637-650.

［19］Foley CJ，Freedman H，Choo SL，et al.Dynamics of RASSF1A/MOAP-1 association with death receptors［J］.Mol Cell Biol，2008，28(14):4520-4535.

［20］Rabizadeh S，Xavier RJ，Ishiguro K，et al.The scaffold protein CNK1 interacts with the tumor suppressor RASSF1A and augments RASSF1Ainduced cell death［J］.J Biol Chem，2004，279(28):29247-29254.

［21］Dammann R，Schagdarsurengin U，Seidel C，et al.The tumor suppressor RASSF1A in human carcinogenesis:an update［J］.Histol Histopathol，2005，20(2):645-663.

［22］Hesson LB，Cooper WN，Latif F.The role of RASSF1A methylation in cancer［J］.Dis Markers，2007，23(1-2):73-87.

［23］Saelee P，Wongkham S，Chariyalertsak S，et al.RASSF1A promoter hypermethylation as a prognostic marker for hepatocellular carcinoma［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2010，11(6):1677-1681.

［24］Malpeli G，Amato E，Dandrea M，et al.Methylation-associated down-regulation of RASSF1A and up-regulation of RASSF1C in pancreatic endocrine tumors［J］.BMC Cancer，2011，11:351.

［25］Tian Y，Hou Y，Zhou X，et al.Tumor suppressor RASSF1A promoter:p53 binding and methylation［J］.PLoS ONE，2011，6(2):e17017.

［26］Schmiemann V，Böcking A，Kazimirek M，et al.Methylation assay for the diagnosis of lung cancer on bronchial aspirates:a cohort study［J］.Clin Cancer Res，2005，11(21):7728-7734.

［27］Dulaimi E，Hillinck J，Ibanez de Caceres I，et al.Tumor suppressor gene promoter hypermethylation in serum of breast cancer patients［J］.Clin Cancer Res，2004，10(18Pt1):6189-6193.

［28］Murray PG，Qiu GH，Fu L，et al.Frequent epigenetic inactivation of the RASSF1A tumor suppressor gene in Hodgkin＇s lymphoma［J］.Oncogene，2004，23(6):1326-1331.

［29］Wang J，Lee JJ，Wang L，et al.Value of p16(INK4a)and RASSF1A promoter hypermethylation in prognosis of patients with resectable non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10:6119-6125.

［30］Endoh H，Yatabe Y，Shimizu S，et al.RASSF1A gene inactivation in non-small cell lung cancer and its clinical implication［J］.Int J Cancer，2003，106(1):45-51.

［31］Choi N，Son DS，Song I，et al.RASSF1A is not appropriate as an early detection marker or a prognostic marker for non-small cell lung cancer［J］.Int J Cancer，2005，115(4):575-581.