高效液相色谱法同步测定食品中5种色素含量

张 玉，王 伟，徐丽红，王建清

(浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021)

碱性嫩黄O、酸性橙II、碱性橙II、罗丹明B、对位红均为偶氮类工业染料。广泛用于纺织、皮革、造纸、橡胶、塑料、涂料、化妆品、木材加工等，它们具有一定的毒性，部分还有致癌性，因此禁止作为食品添加剂使用。但由于工业染料色泽鲜艳、着色稳定且价格低廉，一些不法商贩将其用于食品生产与加工，严重危害了消费者的身体健康［1-2］。

目前对于食品中违禁色素的检测方法已有一定研究，主要有薄层色谱法、液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法［3-9］。但大多数研究集中在对1～2种物质的检测。为此，我们通过固相萃取技术结合高效液相色谱法，建立食品中碱性嫩黄O、酸性橙II、碱性橙 II、罗丹明 B、对位红同步测定方法。现将有关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 检测样品、试剂与仪器

检测样品有辣椒酱和腐竹。

试剂有标准品碱性嫩黄O(纯度95%)、酸性橙II(纯度98%)、碱性橙 II(纯度98%)、罗丹明B(纯度92%)、对位红 (纯度96%);甲醇和乙腈 (色谱纯);乙醇 (分析纯)。

仪器有戴安Ultimate-3000高效液相色谱仪，带紫外检测器;超声波清洗器;旋转蒸发仪;离心机;HLB固相萃取小柱 (200 mg，3 mL)。

1.2 标准溶液配制

准确称取碱性嫩黄 O、酸性橙 II、碱性橙 II、罗丹明B、对位红标准品各0.050 0 g，分别置于50 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为1.0 g·L-1的标准贮备液。

分别吸取5.0 mL 5种标准储备液于100 mL容量瓶中，混匀后，用甲醇定容至刻度，得到浓度为50 mg·L-1的混合标准溶液。再移取50 mg·L-1的混合标准溶液0.1，0.2，1.0，2.0，分别置于10 mL容量瓶中，用流动相定容，此标准系列质量浓度为0.5，1.0，5.0，10.0 mg·L-1。

1.3 样品前处理

称取5.0 g捣碎样品置于50 mL离心管中，加入30 mL乙醇和乙腈混合液 (V/V为80∶20)，高速均质1 min，超声萃取20 min，离心，移出上清液，残渣用30 mL乙醇和乙腈混合液再提取1次，合并上清液，用旋转蒸发仪浓缩近干后，加入2 mL乙醇和乙腈混合液溶解，再加入8 mL水混匀为待净化液。

依次用5 mL甲醇和5 mL水活化固相萃取柱，将待净化液全部上柱。依次用10 mL甲醇和10 mL正己烷洗脱，接收并合并洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩近干后，加2 mL乙醇和乙腈混合液溶解，然后定容。

1.4 色谱分析条件

流动相:甲醇、乙酸铵缓冲液和乙腈梯度洗脱(表1)，色谱柱:C18，4.6 mm×250 mm(5μm);流速:1.0 mL·min-1;柱温:25℃;进样体积:20μL;波长450 nm，480 nm，530 nm。

表1 色谱柱洗脱的流动相梯度

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

对5种色素的标准品进行光谱扫描，发现5种色素的最大吸收波长分别为:碱性嫩黄 O，435 nm;酸性橙II，480 nm;碱性橙II，430 nm;罗丹明B，530 nm;对位红，480 nm。

综合考虑几种色素的最大吸收波长，进行分段波长检测，即0～15 min检测波长为450 nm，15～20 min检测波长为530 nm，20～27 min检测波长为480 nm。

2.2 液相色谱条件的确定

根据样品分离情况，优化流动相流速及配比，确定用甲醇、乙酸铵缓冲液和乙腈梯度洗脱。从图1-2看出，样品中碱性嫩黄O、酸性橙II、碱性橙II、罗丹明 B、对位红能够完全分离，得到理想色谱。

图1 5种工业染料标准物质色谱

2.3 提取液的选择

图2 腐竹样品添标色谱

采用不同的提取液对样品中的色素进行提取，结果 (表2)4种提取液对样品中色素的提取回收率80.2%～101.2%，其中乙醇+乙腈混合液提取后，不同色素回收率为85.1%～98.8%，差异较小，因此确定此混合溶剂作为提取液。

表2 不同提取液提取5种色素的回收率

2.4 固相萃取条件筛选

由于样品提取液中含有一定的杂质，会干扰色素的色谱分离，因此采用固相萃取柱对样品进行净化。先采用标准物质进行固相萃取条件筛选。表3表明，单用洗脱液1(10 mL甲醇)洗脱，对位红的回收率较差，而用洗脱液1洗脱后再用洗脱液2(10 mL正己烷)洗脱，5种色素均能得到较好回收率。

表3 不同洗脱液对5种色素固相萃取回收率的影响

2.5 方法的线性及检出限

将配制好的系列标准工作液上机测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。在浓度为0.5～50 mg·L-1的浓度范围里，5种标准物质具有良好的线性相关 (表4)。方法的检出限为 0.03 ～0.2 mg·kg-1。

2.6 方法回收率

采用辣椒酱和腐竹进行不同添加浓度的样品回收率实验，结果表明，该方法具有良好的准确度和重复性，5种违禁色素回收率为82.5% ～96.9%，相对标准偏差 (RSD)为1.0% ～3.5%(表5)。

表4 方法的线性及检出限

表5 不同食品中5种色素的回收率

3 小结

本研究建立了高效液相色谱同时测定食品中5种色素含量的方法。该方法线性关系良好，在0.5～50 mg·L-1范围内，相关系数为 0.999 8～0.999 9，方法的回收率为82.5% ～96.9%，精密度RSD为1.0%～3.5%，具有较高的准确度和良好的重现性，可作为同时进行食品中碱性嫩黄O、酸性橙II、碱性橙II、罗丹明B、对位红含量测定的方法。

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