醋酸铅对雄性小鼠附睾Y染色体基因Ddx3y蛋白表达的影响

于丽萍，程繁银，李亚晨，朴丰源

(1.大连大学 附属中山医院 内科，辽宁 大连 116001；2.大连医科大学 卫生管理学教研室，辽宁 大连 116044；3.大连医科大学 劳动卫生与环境学教研室，辽宁 大连 116044)

铅是一种常见的有毒重金属和环境污染物。随着经济快速发展，环境铅污染问题日趋严重。铅具有多系统毒性，尤其男性生殖毒性已引起关注。人群流行病学调查和动物实验研究表明，铅暴露不仅对精子的发生，而且对精子的发育和成熟均具有明显的抑制作用[1-2]，但其毒作用机理目前尚不十分清楚。

附睾是精子贮藏、成熟的场所。由睾丸上皮生成的精子只有通过附睾后才获得向前运动能力和受精能力，即达生理上的成熟[3]。本研究用组织病理学技术并结合Western blotting、免疫组化的方法，观察铅对雄性小鼠附睾组织Y染色体基因Ddx3y蛋白的表达影响，探讨该蛋白与铅的生殖毒性作用之间的关系，为阐明铅的雄性生殖毒性机制以及防治铅的生殖毒性危害提供依据。

1 材料和方法

1.1 试 剂

醋酸铅(上海化学试剂厂)；RIPA强裂解液(碧云天生物技术研究所)；一抗为小鼠单克隆抗体(美国SANTA CRUS公司)；二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(美国Sigma公司)；超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术研究所)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术研究所)；DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 动物的选择和饲养

健康昆明种雄性小鼠48只，体重(20±2) g，由大连医科大学实验动物中心提供。按体重将小鼠随机分为4组，每组12只。即对照组、0.5 g/L醋酸铅染毒组、1 g/L醋酸铅染毒组和1.5 g/L 醋酸铅染毒组。饲养小鼠的室内条件如室温(22±2) ℃、湿度(60±5) %等被严格监控，小鼠可以任意饮水和取食(标准食物)，连续染毒60 d。

1.3 组织形态学观察

取附睾组织，经多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm连续切片，苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下进行组织形态学观察。

1.4 Western blotting测定Ddx3y蛋白表达

将附睾组织在液氮中研磨，组织匀浆器匀浆，用RIPA强裂解液(碧云天生物有限公司)4 ℃裂解细胞30 min，在使用前数分钟加入PMSF，13 000 r 20 min离心提取组织总蛋白, BCA试剂盒对蛋白进行定量，β-actin作为内参，蛋白样品经10% SDS-PAGE电泳分离，电泳结束后湿式转膜20 min，抗体结合，ECL显色发光，UVP扫描分析。一抗为小鼠单克隆抗体(美国SANTA CRUS公司，sc-11023)，稀释度为1∶1500 (v/v)，β-actin一抗为鼠抗鼠单克隆抗体(美国Sigma公司)，稀释度为1∶1500 (v/v)。二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(美国Sigma公司),稀释度为1∶5000(v/v)。

1.5 免疫组织化学方法观察附睾组织

将切片放入装有抗原修复液的容器中，至微波炉加热，使容器内液体温度保持在92～98 ℃，并持续10～15 min。5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育15 min。倾去血清，滴加一抗为小鼠单克隆抗体，稀释度为1∶80 (v/v)，37 ℃烤箱2 h。PBS漂洗后，滴加二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，37 ℃烤箱10 min。滴加DAB显色液显色10 min，自来水充分漂洗，苏木素复染1 min，二甲苯透明，中性树胶封片，进行图像采集。

1.6 统计学方法

计量资料结果用均数±标准差形式表示，应用SPSS16.0统计软件对数据进行统计分析。采用单因素方差分析和组间比较采用SNK-q检验法分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 附睾组织病理学观察

对照组可见附睾管中位于基膜上的一行排列整齐的小圆形细胞核的基细胞，附睾管结构完整，内含大量精子和分泌液(图1A)。而染铅组附睾管内精子数和分泌液均减少，尤其 1.5 g/L染铅组最为明显(图1D)。

图1 小鼠附睾组织形态学变化(HE染色)Fig 1 Morphological changes in the epididymis of mice (HE staining)A为对照组；B为0.5 g/L 染铅组；C为1.0 g/L 染铅组；D为1.5 g/L染铅组sp: sperms； pc: principal cells； L: seminiferous lumen. Scale bars, 50 μm

2.2 醋酸铅对附睾组织Ddx3y蛋白表达影响

Western blotting检测结果显示，醋酸铅染毒组小鼠附睾组织中Ddx3y蛋白表达显著低于对照组，并随染铅剂量的增加而降低，其中1.5 g/L染铅组Ddx3y蛋白表达量降低最为明显(P<0.01)。β-actin作为内参(图2、图3)。

2.3 附睾组织的免疫组织化学观察

附睾免疫组化结果显示，抗Ddx3y蛋白免疫反应阳性细胞均呈棕黄色，免疫反应特异性产物主要分布在基细胞胞核周围，各组均可见输精管中有少量精子。染铅组可见，随着染铅剂量的增加，抗Ddx3y蛋白免疫反应强度逐渐降低(图3)。

3 讨 论

Telisman[4]对101名接铅工人进行调查，发现血铅与精液量、精子密度、精子活力和精子活率呈明显负相关。Wadi等[5]用含不同浓度铅的饮水饲养雄性成熟小鼠6周，结果显示铅暴露组附睾内精子数量明显减少，精子数量和活动精子所占比例降低。本实验结果表明，染铅组附睾管内精子数显著低于对照组，与上述流行病学调查和动物实验结果一致，提示铅暴露对精子的发育、成熟均具有明显的抑制作用。

图2 各剂量组小鼠附睾组织中Ddx3y蛋白表达结果Fig 2 Expression of Ddx3y protein in the epididymis of mice

图3 Ddx3y蛋白在附睾组织的表达分布Fig 3 Distribution of Ddx3y protein expression in the epididymis of miceA为对照组；B为0.5 g/L 染铅组；C为1.0 g/L 染铅组；D为1.5 g/L 染铅组sp: sperms; pc: principal cells; L: seminiferous lumen. Scale bars, 50 μm

长期以来，Y染色体一直是男性不育遗传因素的重点研究对象。1996年Vogt等将Y染色体长臂上主导精子形成的区域分为AZFa、AZFb、AZFc区。AZFa区包含3个基因，DDX3Y (DBY)、USP9Y和UTY[6],目前认为DDX3Y为与男性不育有关的主要候选基因。小鼠也有与人的Y染色体同源基因Ddx3y，位于Y染色体断臂(Yp)Sxrb区间[7]。小鼠Ddx3y编码的蛋白参与雄性生殖功能，与人类DDX3Y编码的蛋白具有高度同源性[8]。本实验的Western blotting和免疫组织化学检测结果均显示，染铅组小鼠附睾组织中Ddx3y蛋白表达显著下调，且具有剂量-反应关系，表明铅对小鼠附睾组织Ddx3y蛋白表达具有明显的抑制作用。这些结果提示，抑制附睾组织Ddx3y蛋白表达可能与铅诱导雄性生殖毒性作用有关。今后，有必要从mRNA水平验证铅对Ddx3y表达的影响及深入探讨Ddx3y蛋白表达下调与铅的雄性生殖毒性作用之间的内在联系。

[1] Wirth JJ, Mijal RS. Adverse effects of low level heavy metal exposure on male reproductive function[J]. Syst Biol Reprod Med, 2010, 56(2): 147-167.

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[4] Telisman S, Prpic MD, Kersanc A. Relationships between blood lead and indicators of effect in cows environmentally exposed to lead[J]. Toxicol Lett, 1990, 52(3): 347-356.

[5] Wadi SA, Ahmad G. Effects of lead on the male reproductive system in mice[J]. Toxicol Environ Health A, 1999, 56(7): 513-521.

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