金黄色葡萄球菌rep-PCR指纹图谱分型技术反应条件的优化

林 琳，王 晶

(大连医科大学 附属第一医院 检验科， 辽宁 大连 116011)

金黄色葡萄球菌分型方法可分为表型分型和基因分型，随着分子生物学理论和实验技术的不断完善，基因分型技术在判断院内感染爆发流行，了解菌株间的相关性，确定传染源与流行趋势方面具有重要的意义并被广泛使用[1]。rep-PCR即重复序列引物聚合酶链反应技术是根据基因组中的重复序列设计引物，扩增重复序列间的片段，通过电泳产生的特异性指纹图谱鉴别细菌基因组间的差异[2]。主要的重复片段主要分为基因外回文序列(rep)和肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)两种。这种新方法相对于“金标准”的脉冲场电泳，操作简单易行，在实验室可广泛应用。但其结果的重复性和指纹图谱的清晰程度与实验条件密切相关。本研究针对两种不同的实验引物，以及引物浓度和退火温度进行优化，以期得到最佳的指纹图谱。

1 材料和方法

1.1 材 料

金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923(本室保藏)；细菌基因组提取试剂盒、溶菌酶(北京天根生化科技有限公司)；Taq 酶、maker及PCR相关试剂(大连宝生物工程有限公司)；相关rep-PCR引物序列(引物rep：TCGCTCAAAACAACGACACC/引物ERIC-Ⅱ:AAGTAAGTGAGTGGGGTGAGCG)(均合成于大连宝生物工程有限公司)。

1.2 细菌基因组DNA的提取

接种菌株于LB培养基中，35 ℃摇床培养18～24 h，收集菌株于EP管中，加入100 U/mL溶菌酶 20 μL，37 ℃孵育破壁30 min以上，按照基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取，最后用100 mL TE buffer 洗脱，-20 ℃低温保存。

1.3 rep-PCR扩增引物的筛选

根据参考文献[3-4],引物ERIC-Ⅱ及引物rep均可以用于rep-PCR的扩增，其反应体系均为：总反应体系25 μL，DNA模板5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL, 25 mmol/L Mg2+2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL, 5 U/μL Taq酶 0.3 μL，100 pmol/μL引物ERIC-Ⅱ 0.2 μL，100 pmol/μL引物REP 0.25 μL，双蒸水补足。

设定循环参数为95 ℃预变性3 min，94 ℃ 60 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像。

1.4 rep-PCR反应体系的优化

以引物rep作为实验引物，在不同的引物浓度(0.8、1.0、1.2 pmol/μL)下进行PCR检测，其他条件一致，在不同的退火温度下(35、40、45、50、55 ℃)进行PCR检测，其他条件一致。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像。

2 结 果

2.1 rep-PCR 引物的筛选

分别用引物ERIC-Ⅱ及引物rep对标准菌株ATCC25923进行扩增，可见引物rep扩增出的条带数量和亮度均好于引物ERIC-Ⅱ，所以本实验选用引物rep作为扩增金黄色葡萄球菌的引物，见图1。

图1 不同的引物进行rep-PCR扩增Fig 1 The rep-PCR products at different primer

2.2 rep-PCR反应体系的优化

2.2.1 引物浓度的优化：当引物浓度分别为0.8 pmol/μL，1.0 pmol/μL，1.2 pmol/μL时，均可扩增出较多的条带，其中以浓度为1.0 pmol/μL时的条带数量最多，亮度最强，终选择引物浓度1.0 pmol/μL为最终的引物浓度。见图2。

图2 rep-PCR引物浓度的优化Fig 2 The rep-PCR products at different primer concentration

2.2.2 退火温度的优化：当退火温度为35、40、45、50、55 ℃时，以退火温度为45 ℃时条带数量最多，亮度最强，终选择以45 ℃为最终的退火温度。见图3。

3 讨 论

有关基因分型的方法有很多种，包括染色体DNA限制性内切酶的分析、PFGE、REPD、rep-PCR等，每种方法都有其各自的优缺点。rep-PCR即重复序列引物聚合酶链反应技术，是以基因组的一段重复回文序列为引物，对细菌基因组的DNA进行PCR扩增，根据得到的指纹图谱可对细菌进行同源性分析[5]。rep-PCR两种主要重复序列片段是基因外回文序列(rep)和肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)，这两种引物分别来自肺炎支原体和大肠杆菌的重复序列片段。用引物rep和引物ERIC-Ⅱ分别对金黄色葡萄球菌ATCC25923进行扩增，均可扩增出指纹图谱，只是数量和亮度上有所差异，应用引物rep扩增出的条带数量和亮度上都好于引物ERIC-Ⅱ，可见引物rep和引物ERIC-Ⅱ均可以用于金黄色葡萄球菌的同源性分析，由于rep-PCR扩增理想的指纹图谱亮度越高越好,且数量在6～8条之间，故认为对于金黄色葡萄球菌进行rep-PCR指纹图谱分析，基因外回文序列(rep)优于肠杆菌间重复序列(ERIC)。

图3 rep-PCR退火温度的优化Fig 3 The rep-PCR products at different annealing temperature1～5：退火温度分别为35、40、45、50、55 ℃, M:Marker

rep-PCR具有分辨率好，操作简单易行等优点，但也有其局限性，其中主要的原因是结果的重复性与实验条件密切相关，反应条件不同，所得到的指纹图谱不同。所以本研究以ATCC25923为模板，对引物浓度以及退火温度进行优化，希望得到最佳的扩增条件。首先，在其他反应条件固定的条件下，引物浓度设为3个梯度进行扩增，分别为0.8、1.0、1.2 pmol/μL，当引物浓度为1.0 pmol/μL时，扩增出的效果最佳；另外退火温度的高低对扩增的结果也有较大的影响，在理想状态下，退火温度足够低，可以保证引物的目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异扩增[6]，故本研究在其他反应条件固定的情况下，将退火温度设为35、40、45、50、55 ℃ 5个梯度，当退火温度为45 ℃时，扩增的条带数和亮度均好于其他，高于相关文献报道[7]。综上所述，本研究为金黄色葡萄球菌的rep-PCR分型找出了最佳的反应条件，为金黄色葡萄球菌的同源性分析提供了依据。

[1] 王凤玲.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因的研究进展[J].中国感染与化疗杂志,2010,10(1):72-75.

[2] 孙桂珍,于艳华.50株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PVL基因检测及同源性分析[J].中华医院感染学杂志,2009,19(12):1471-1474.

[3] Okada T, Takada K, Fujita K, et al. Differentiation of banding patterns between Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus isolates in rep-PCR using ERIC primer [J]. J Oral Microbiol, 2011, 3:7190-7194.

[4] Duan H, Chai T, Liu J, et al. Source identification of airborne Escherichia coli of swine house surroundings using ERIC-PCR and REP-PCR[J].Environ Res,2009, 109:511-517.

[5] 刘霞,刘社兰,解奕瑞，等.基于16S rRNA基因和细菌基因组间重复序列的DNA指纹图谱技术对肝硬化大鼠肝移植后肠道菌群多样性的研究[J].中国微生态学杂志,2010,22(3):193-198.

[6] 黄培堂.分子克隆实验指南[M].第3版.北京:科学出版社,2002.393-396.

[7] 汪川,余倩,康睿,等.金黄色葡萄球菌REP-PCR指纹图谱分型方法优化[J].中国公共卫生,2009,25(11):1354-1356.