Rad18缺失对雄小鼠生殖细胞的影响

孙婧华，刘立峰

(1.大连医科大学 附属第二医院 肿瘤内科， 辽宁 大连 116027；2.大连医科大学 附属第一医院 妇产科，辽宁 大连 116011)

紫外照射、生殖毒素能引起多种DNA损伤。DNA损伤后在复制期引起复制叉不稳定从而导致细胞死亡。复制后修复(postreplication repair, PRR)能不去除损伤模板而恢复DNA复制。该种修复在多种物种中可见，主要包括以下3个过程：损伤DNA合成 (TLS)、重组和模板转换[1]。

芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，Rad6 epistasis家族参与复制后修复过程。其中编码泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的Rad6和18在PRR中起关键作用[2]。Stelter[3]指出Rad6/Rad18决定复制后修复PCNA泛素化。目前，人的细胞中已鉴定出一个Rad18同源物(hRad18)[4]和两个Rad6同源物(HHR6A和HHR6B)[5]。hRad18和mRad18在PRR通过PCNA单或多泛素化而维持基因信息稳定[4,6]。小鼠中，mRAD18在胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)和成年小鼠睾丸粗线期精母细胞中高表达[6-7]，定位于XY体[7-8]。Roest等[9]报道mRad6B敲除雄小鼠在减数分裂后染色体重塑过程受损而不育，认为mRad18对精子发生起重要作用。本文利用Rad18-/-小鼠模型研究Rad18缺失对雄小鼠生殖细胞的影响。

1 材料和方法

1.1 材 料

动物：C57BL/6J 野生小鼠(wild-type,WT)和Rad18-/-雄小鼠，来源于日本熊本大学动物实验中心。1、6周龄WT雄小鼠各3只， 2、6、12月龄的WT和Rad18-/-雄小鼠各5只。

抗体和试剂：生殖细胞特异标记物TRA98一抗购自Bioacademia公司；二抗VECTASTAIN试剂盒购自Vector Laboratories公司。Rad18一抗来源于日本熊本大学组织制御实验室；二抗购自Jackson ImmunoResearch公司。TSA plus 生物素体系信号放大NEL700购自Perkin-Elmer公司，DAB显色检测购自Roche公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生精小管及附睾中生殖细胞的检测：取2、6、12月龄WT和Rad18-/-雄小鼠各5只，取睾丸和附睾，于Bouin’s 固定液室温固定4 h，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋。切片：厚度为4 μm。采用常用步骤行TRA98免疫组织化学检测。TRA98阳性(棕色)为精原细胞，精母细胞，圆形精细胞，阴性(蓝色)为延长的精细胞和体细胞。

1.2.2 退化睾丸生精小管分类：根据退化管中TRA98标记的不同种类生殖细胞存在情况，将生精小管分为5类。0: 仅存在Sertoli细胞或同时存在拉长的精细胞；I: 存在Sertoli细胞和精细胞(包括圆形和拉长)，II: 存在Sertoli细胞、精母细胞和精细胞；III: 存在Sertoli细胞、精原细胞和精母细胞；IV:正常结构。分别计数分布情况并制图。

1.2.3 生殖细胞中Rad18表达的检测：取1、6周龄各3只WT雄小鼠睾丸，于4%多聚甲醛中4 ℃固定过夜。甲基丙烯酸甲酯包埋，切片：厚度为5 μm。采用常用步骤行Rad18免疫组织化学检测。

1.2.4 原位杂交：组织切片同Rad18检测切片，利用mRad18 cDNA 的OFR区上的471碱基cDNA片段制成Rad18反义和正义探针。原位杂交采用Tadokoro的方法[10]。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 Rad18-/-雄小鼠生殖细胞检测

Rad18-/-小鼠睾丸组织切片HE染色发现Rad18-/-雄小鼠随年龄增加，睾丸组织中生精小管退化。应用生殖细胞特异标记物TRA98检测退化生精小管中生殖细胞表达，结果见图1。与WT小鼠睾丸类似，12月龄Rad18-/-雄小鼠睾丸表面正常生精小管中含有精子生成过程中的生殖系细胞：精原细胞、精母细胞、圆形和拉长的精细胞以及精子。相反，同一睾丸的退化小管中，TRA98阳性生殖系细胞分布异常。

2.2 Rad18-/-雄小鼠随年龄增长精原细胞的变化

2、6、12月龄WT小鼠睾丸组织中正常生精小管(第IV类)比例无明显变化(图2A)，分别为97.00%、97.54%和96.82%；但2、6、12月龄Rad18-/-小鼠睾丸组织中正常生精小管比例明显下降(图2B)，分别为99.42%、83.79%和58.54%，两组相比差异有显著性意义(P<0.05)；同时，Rad18-/-小鼠睾丸组织中第0、I 和II类异常生精小管比例均随着年龄增长而逐渐增高，2、6、12月龄时，这3类异常结构比例总和为：0.58%、15.08%和39.50%(图2B)，而2、6、12月龄WT小鼠中总和分别为0.70%、1.99%和2.76%(图2A)，这3类异常结构的共同特点即缺乏含有精原干细胞的精原细胞，12月龄Rad18-/-雄小鼠39.50%的生精小管中缺失早期精原细胞，与WT小鼠的2.76%比较差异有显著性意义(P<0.05)；WT和Rad18-/-小鼠中第III类异常小管比例均无显著变化(图2)。

2.3 12月龄Rad18-/-雄小鼠精子形态

虽然12月龄Rad18-/-雄小鼠39.5%的生精小管中缺失早期精原细胞，但在附睾中的精子形态与WT相比未见异常，未见TRA98阳性未完成分化的生殖细胞提前释放，见图3。图1C-F中可见形态正常的Sertoli细胞。

图1 12月龄Rad18-/-小鼠睾丸中生殖细胞特异性标记TRA98的表达 ×400Fig 1 Expression of germ line cell-specific marker TRA98 in 12-month-old Rad18-/- testes ×400A：12月龄WT小鼠生精小管；B：12月龄Rad18-/小鼠正常生精小管；C-F:12月龄Rad18-/-小鼠退化生精小管

图2 根据生殖细胞存在情况小鼠生精小管分类及分布Fig 2 Distribution of the seminiferous tubules showing each category of germline cellsA：WT小鼠 B：Rad18-/-小鼠

图3 Rad18-/-小鼠附睾中未见TRA98阳性生殖细胞 ×400Fig 3 The spermatozoa in the epididymis of 12-month-old Rad18-/- mice displayed normal morphology ×400 A：WT小鼠 B：Rad18-/-小鼠

2.4 Rad18在野生雄小鼠精原细胞中的表达

在6周龄WT雄小鼠生精小管中，Rad18蛋白在精母细胞中表达，尤其定位在XY体上。Rad18蛋白在精原细胞细胞核中表达。原位杂交显示Rad18 mRNA在精原细胞和精母细胞都表达。1周龄WT小鼠精原细胞处于未分化精原细胞增殖激活状态，免疫组化结果显示1周龄WT小鼠睾丸中的精原细胞核中表达Rad18蛋白，见图4。

3 讨 论

多项研究表明，RAD18不但参与了PRR[11]，而且参与了DNA损伤诱导基因的转录调节[12]、DNA损伤信号的传导[13]，也参与了DNA单链断裂和断裂的修复[14-17]。Miyase等[18]报道Rad18-/-小鼠细胞中有明显的复制后修复缺陷。Rad18敲除的mESCs对多种遗传毒素试剂敏感，异常重组频率提高，说明RAD18对维持细胞基因组稳定起重要的作用[7]。作者已经建立了Rad18-/-小鼠模型，该小鼠出生、成长正常，但随年龄增加雄小鼠生育力下降，睾丸重量减轻，生精小管退化、生殖细胞丢失，并且研究表明这种退化不是因激素变化而引起。

图4 Rad18蛋白和mRNA在WT小鼠睾丸中的表达Fig 4 The expression of Rad18 in WT mice

本研究应用免疫组织化学方法检测生殖细胞特异标记物TRA98在2、6、12月龄Rad18-/-雄小鼠生精小管生殖细胞中的表达和分布，发现伴随着正常生精小管比例的下降，缺乏精原细胞的退化小管比例增加，12月龄时已达39.50%，与同龄WT小鼠2.76%相比差异有显著意义，与此同时，退化小管中仍可见处于不同分化阶段的生殖细胞：精母细胞、圆形和拉长的精细胞以及精子，并且Sertoli细胞形态正常，附睾中未见异常生殖细胞，提示已分化的生殖细胞可完成精子形成，精原细胞的耗尽导致Rad18-/-雄小鼠生育力下降。

精原细胞中存在精原干细胞，精原干细胞整倍性维持对遗传信息传递起关键作用。研究已表明，多种DNA损伤修复机制参与了干细胞的维持，包括非同源末端连接(NHEJ)和核苷酸切除修复(NER)[19-20]。DNA连接酶IV 介导的NHEJ 完成DNA双链断裂修复。随年龄增加，DNA连接酶IV次形态突变(Lig4Y288C)引起小鼠造血干细胞和骨髓细胞逐渐丢失，严重影响了组织培养和移植中干细胞功能[23]。运动失调性毛细血管扩张症(Atm)突变基因通过激活DNA修复中细胞周期关键蛋白维持基因组稳定。Atm突变小鼠24周出现因造血干细胞缺陷而导致的骨髓缺陷[21]。Takubo等[22]发现Atm-null小鼠睾丸中逐渐失去减数分裂前生殖细胞。因此，DNA修复机制对于维持干细胞整倍性和遗传信息传递起关键作用。

尽管Rad18蛋白在成年睾丸精母细胞中高表达，但是本研究检测到Rad18转录水平在精原细胞而非精母细胞高表达。此外，1周龄WT小鼠睾丸中未分化精原细胞表达Rad18蛋白，说明Rad18在增殖的未分化精原细胞具有活性。在Rad18-/-小鼠睾丸中，由于Rad18功能丧失，DNA损伤加剧，随着年龄增加内源性DNA损伤或基因组重排可能加速精原细胞增殖，导致长期细胞周期阻滞，精原干细胞耗尽。

本研究结果提示，Rad18参与维持DNA复制中基因组DNA整倍性，对精原干细胞维持起重要作用。

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