荧光原位杂交技术在膀胱癌诊断中的临床应用▲

覃智标 蒙清贵 毕革文 文亦磊 黄瑞旭

(1广西中医药大学第一附属医院泌尿外科，南宁市 530023;2广西医科大学附属肿瘤医院泌尿外科，南宁市 530021;3广西中医药大学第一附属医院病理科，南宁市 530023)

荧光原位杂交技术在膀胱癌诊断中的临床应用▲

覃智标1蒙清贵2毕革文1文亦磊3黄瑞旭1

(1广西中医药大学第一附属医院泌尿外科，南宁市 530023;2广西医科大学附属肿瘤医院泌尿外科，南宁市 530021;3广西中医药大学第一附属医院病理科，南宁市 530023)

目的探讨荧光原位杂交技术(FISH)在膀胱癌诊断中的临床应用价值。方法对30例可疑膀胱尿路移行上皮细胞肿瘤的血尿患者的尿液标本同时行尿脱落细胞学检测和荧光原位杂交分析，并与最终的病理学检查结果对比。结果尿脱落细胞学的灵敏度为33.33%，特异度为100%，FISH的灵敏度为85.71%，特异度为 88.89%，两者灵敏度相比差异具有统计学意义(P＜0.05)，而两者特异度相比差异无统计学意义(P＞0.05)。结论FISH技术在检测膀胱移行上皮细胞癌方面具有较高的灵敏度和特异度，在膀胱癌的诊断中具有重要的临床意义和实用价值。

荧光原位杂交;膀胱癌;细胞学;诊断

膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，在我国男性泌尿生殖系统肿瘤中，其发病率和死亡率均占首位。早期发现和诊断膀胱癌对于患者的治疗和预后意义重大。为避免传统的侵入性检查方法如膀胱镜检等给患者带来的痛苦和尿道损伤、泌尿系感染等风险，以及针对尿脱落细胞学敏感度较底的不足，我们将荧光原位杂交技术(FISH)技术用以诊断膀胱癌，并与尿脱落细胞学检查结果相比较，评估FISH技术在膀胱尿路上皮癌诊断中的临床应用价值。

1 资料和方法

1.1 临床资料 2010年1月至2012年1月收集广西中医药大学第一附属医院30例住院患者的尿液标本，纳入的标准为经影像学和实验室检查除外泌尿系结石及肾、输尿管、前列腺病变和泌尿系感染等引起的血尿者。其中男性18例，女性12例，年龄24～80岁，平均(50±12)岁。

1.2 仪器和试剂 荧光原位杂交操作平台:OLYMPUS BX51系统显微镜，OLYMPUS BX-UCB通道转换系统，X-cite SERIES120荧光灯，DELL微型计算机，Prog Res Capture Pro 2.5 摄像系统，VIDEOTEST-FISH 2.0 图像分析处理系统;上海跃进SHHW 21420三用恒温水浴箱和上海博迅HPX-9052 MBE恒温培养箱，Seven Milti型 pH/电导率/离子综合测试仪和常熟双杰T 200型电子天平，长沙湘智TXZ5-WS台式离心机。实验中应用的 FISH试剂购自北京金菩嘉医疗科技有限公司，为GLPP 16/CSP 17(红色/绿色)和CSP 7/CSP 3(红色/绿色)两组。

1.3 实验方法 患者均在膀胱镜检查前行尿脱落细胞FISH检测和细胞学检查。连续3 d留取晨尿200 mL，1 h内送检。采用一次性使用的清洁干燥容器，注意避免标本污染。每份尿样分为2份，分别行尿脱落细胞学检查和FISH检测，并将其检测结果与最终的病理检查结果对比。

1.3.1 FISH 检测方法

1.3.1.1 标本配制 新鲜尿液标本离心后去上清液，依次加入胶原酶B 2 mL、KCl低渗溶液5 mL、甲醇固定液2 mL后离心去除上清液;加固定液5 mL，室温静置5 min，再次离心去上清液;加固定液5 mL重复固定1次;离心后去除上清液后滴片;室温下过夜老化玻片。

1.3.1.2 标本处理 用 Rnase(Sigma，0.1 g/L)和 Pepsin(Sigma，0.1 g/L)先后处理，多聚甲醛固定 15 min。PBS缓冲液洗涤后，玻片加700 ml/L甲酰胺/2xSSC(pH 7.0)溶液，72℃变性3 min，2xSSC －4℃ 3 min洗涤2次，梯度乙醇脱水，室温晾干。

1.3.1.3 杂交 将探针加到玻片的标本上覆盖玻片，Rubber Cement封片后置湿盒37℃温箱中避光杂交48 h。

1.3.1.4 洗片 除去盖玻片，将玻片放入500 ml/L甲酰胺/2xSSC溶液，42℃洗涤 15 min。2xSSC室温摇洗3 min×2次，梯度乙醇脱水，室温暗处晾干，加2 mL二氨基苯基吲哚(DAPI，Vysis公司)复染，封片。送荧光显微镜下观察，CCD摄取图像并进行图形分析统计。

1.3.1.5 结果判定 本研究的阳性结果判断完全依据金菩嘉公司提供的标准进行。分为红色(GLPP 16和CSP 7探针)和绿色(CSP 17和CSP 3探针)两种信号。4个探针中有2种或者2种以上的探针异常信号出现就可以判定为阳性结果。

1.3.2 尿脱落细胞学检查 将受检患者的尿液标本离心后取脱落细胞制成病理涂片，用显微镜进行观察。每例患者连续留取3 d尿液标本做脱落细胞学检查，发现1次癌细胞即可判定为阳性结果。

1.4 统计学方法 用 SPSS 13.0软件进行分析统计，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

以膀胱镜和术后病理检查结果作为诊断的金标准，该30例患者通过膀胱镜活检或手术后病理检查明确诊断为膀胱移行上皮细胞癌患者21例，膀胱良性病变9例。尿脱落细胞学的灵敏度为33.33%，特异度为100%;FISH的灵敏度为85.71%，特异度为88.89%，两者灵敏度相比差异具有统计学意义(P＜0.05)，而两者特异度相比差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

表1 两种检测方法灵敏度及特异度比较

3 讨论

目前，膀胱癌的诊断、检测主要以膀胱镜检查组织活检和尿脱落细胞学检查为主。前者较直观且准确性高，但对于肉眼难辨的微小扁平肿瘤发现困难，易造成漏诊［1］，且为有创性检查，可能损伤尿道引起尿道狭窄，甚至造成假道，同时也增加了逆行尿路感染的风险，部分患者很难接受膀胱镜检所带来的痛苦;后者特异性高，但对低级别肿瘤的诊断敏感性较低。目前文献报道的尿脱落细胞学检测膀胱癌的敏感度为13% ～75%，特异度为85% ～100%［2］。因此，如何能够以一种无创、快速的方法对膀胱癌进行检测，同时又能够具有较高的敏感性和特异性，成为目前临床上亟待解决的问题。

FISH是一种应用荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体中显示DNA(或RNA)序列位置的方法。根据碱基互补配对的原则，利用已知的荧光素标记的单链DNA(或RNA)与待检材料中未知的单链DNA(或RNA)进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。FISH具有安全、快速、灵敏度高、检测信号强、杂交特异性高、能同时显示多种颜色等优点，不仅能显示细胞中期分裂相，还能显示间期核［3］。作为一种新兴的检测技术，FISH广泛应用于血液肿瘤、实体肿瘤的诊断与检测。目前研究已证实3号、7号、9(p16)号、17号染色体的遗传学改变与膀胱癌的早期发生及发展、复发密切相关［4］。而本组研究所采用的FISH探针则是针对以上四种染色体的。

目前国内不少报道已指出，FISH在诊断膀胱尿路上皮癌方面较尿细胞脱落学检查具有更高的敏感性，而特异性相似［5～7］。本组研究结果显示，尿脱落细胞学的灵敏度为33.33%、特异度为100%，FISH的灵敏度为85.71%、特异度为 88.89%，两者灵敏度相比差异具有统计学意义(P＜0.05)，而两者特异度相比差异无统计学意义(P＞0.05)，与目前的研究报道结果相似。可见，FISH在诊断及检测膀胱癌方面同时具有较高的敏感度和特异度，且该方法简便、迅速、安全，可以很好地弥补膀胱镜检及尿脱落细胞学检查的不足之处。

FISH检测方法安全、快速，灵敏度及特异度均较高，且探针可长时间保存，可多色标记，结果观察简单直观，除用于脱落细胞检测外，还可广泛运用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本等多种物质的检测。该方法在各系统实体肿瘤及血液肿瘤的诊断及监测中均可采用，具有重要的临床实际运用价值。

［1］ Schmidbauer J，Witjes F，Schmeller N，et al.Improved detection of urothelial carcinoma in situ with hexaminolevulinate fluorescence cystoscopy［J］.J Urol，2004，171(1):135 －138.

［2］ Van Rhijn BW，van der Poel HG，van der Kwast TH.Urine markers for bladder cancer surveillance:a systematic review［J］.Eur Urol，2005，47(6):736 －748.

［3］ Stephens JL，Brown SE，Lapitan NL，et al.Physical mapping of barley genes using an ultrasensitive fluorescence in situ hybridization technique［J］.Genome，2004，47(1):179 －189.

［4］ Phillips JL，Richardson IC.Aneuploidy in bladder cancers:the utility of fluorescent in situ hybridization in clinical practice［J］.BJU Int，2006，98(1):33 －37.

［5］ 姚 昊，韩 永，蔡 明，等.荧光原位杂交技术诊断膀胱尿路上皮癌临床研究［J］.中华实用诊断与治疗杂志，2011，25(6):535－538.

［6］ 陈瑞廷，杨锦建，贾占奎，等.荧光原位杂交技术在膀胱癌诊断中的应用［J］.郑州大学学报(医学版)，2011，46(3):460 －462.

［7］ 曹会彦，刘智明，乜国雁，等.荧光原位杂交技术在膀胱癌诊断中的临床应用［J］.中国老年学杂志，2011，31(15):2809 －2811.

R 737.14

B

1673-6575(2012)06-0605-03

广西中医药大学重点科研课题(项目编号:2D2009004)

覃智标(1968～)，男，本科，副主任医师，研究方向:FISH技术在膀胱癌的诊断应用。

2012-08-11

2012-10-27)