鲍曼不动杆菌中16S r RNA甲基化酶基因的分布与耐药性分析

胡少春， 童先丽， 雷旦生

鲍曼不动杆菌中16S r RNA甲基化酶基因的分布与耐药性分析

胡少春， 童先丽， 雷旦生

目的分析湖北省肿瘤医院临床分离鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性，并研究其16S r RNA甲基化酶基因armA和rmtB的分布。方法收集该院2009年3月—2010年5月临床分离的鲍曼不动杆菌，采用K-B法进行药敏试验，用PCR法筛选16S r RNA甲基化酶基因armA、rmtB，并对阳性标本进行测序。结果56株鲍曼不动杆菌中armA基因阳性21株（37.5%），未检出rmtB基因菌株。armA基因阴性菌株对氨基糖苷类抗生素的耐药率显著低于armA基因阳性菌株。结论近年来该院鲍曼不动杆菌分离率逐年增高。16S rRNA甲基化酶基因armA在鲍曼不动杆菌广泛存在，且对多种抗生素耐药，应引起临床医师高度关注。

鲍曼不动杆菌； 16S r RNA甲基化酶基因； 氨基糖苷类抗生素； 耐药性

鲍曼不动杆菌属不发酵糖革兰阴性杆菌，是医院感染的重要病原菌。该菌广泛分布于医院环境中，在免疫力低下的患者中可引起严重感染，如肺炎、血流感染、脑膜炎等。随着抗菌药物的广泛使用，多重耐药（同时耐3种以上不同化学结构的抗菌药物）的不动杆菌的比率也在增加，并可造成医院内的暴发流行［1］，令抗感染治疗非常困难。在2006—2007年Mohnarin细菌耐药监测中，鲍曼不动杆菌在该类菌中所占比率仅次于铜绿假单胞菌而位居第2位［2］。随着抗生素的广泛应用，鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类、β内酰胺类、氟喹诺酮类等抗菌药物出现多重耐药［3］，尤其是在ICU、呼吸科、血液科病房引起的暴发流行，病死率很高，给临床治疗带来了严峻的挑战。

氨基糖苷类抗生素是治疗鲍曼不动杆菌所致的严重感染的最常用的药物之一，在感染性疾病的治疗中发挥着举足轻重的作用。大量氨基糖苷类抗生素在临床上的应用，也造成了一种选择性压力，促使新的耐药基因产生。16S r RNA甲基化酶介导的对氨基糖苷类抗生素耐药给临床治疗造成难题。本研究主要采用PCR技术筛查我院临床分离鲍曼不动杆菌中的16S r RNA甲基化酶armA和rmtB基因，以了解它们的分布情况。

材料与方法

一、材料

（一）菌株来源 收集我院2009年3月—2010年5月住院及门诊患者送检的痰、咽拭、引流液、中段尿、血、胸腹水及各种创面分泌物中分离出的鲍曼不动杆菌共56株。

（二）抗菌药物药敏试验纸片和实验器材 阿米卡星、庆大霉素、链霉素和奈替米星的药敏试验纸片均购于OXOID公司。ABI7000全自动PCR扩增仪购自美国PE公司。Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、d NTP、DNA marker购自大连宝生物工程有限公司；PCR引物由上海闪晶分子生物工程公司合成，各引物序列见表1。MH琼脂培养基购自杭州天和微生物试剂有限公司。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853。

二、方法

（一）细菌鉴定 用VITEK 32型全自动微生物鉴定仪（法国生物梅里埃公司产品）进行鉴定。

表1 PCR扩增基因引物序列Table 1.The sequences of primers used for PCR amplification

（二）药敏试验 采用K-B纸片扩散法，将待检菌稀释成0.5麦氏单位浓度的菌液，均匀涂布于MH平皿，待平皿稍干后贴药敏试验纸片，每个纸片中心至少相距24 mm。药敏试验结果按CLSI 2008年标准判读［6］。

（三）模板制备 从血平皿上挑取3～4个菌落，加入0.85%氯化钠溶液300μL，制成细菌悬液，混匀。10 000 r／min离心5 min，弃去上清液，加入无菌双蒸水300μL，混匀。细菌悬液100℃，15 min水浴后，12 000 r／min离心2 min，弃去上清液，取底部沉淀作为DNA模板。

（四）PCR体系 反应体系为50μL，含10×PCR buffer 5μL，d NTP 4μL，DNA模板3μL，上下游引物 （20 pmol）各 1μL，Taq 酶 （5 u／μL）0.25μL，d H2O 34μL。

（五）反应条件［7］

1.armA：94℃变性5 min；94 ℃变性45 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min为1个循环，共30个循环；72℃延伸10 min。

2.rmtB：94℃变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min为1个循环，共30个循环；72℃延伸7 min。

扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳观察特异性扩增条带。

（六）DNA序列测序 由上海闪晶分子生物科技有限公司协助完成。

三、数据统计分析

用WHONET 5.4软件及SPSS 13.0软件进行数据处理和分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、药敏试验结果

56株鲍曼不动杆菌对4种氨基糖苷类抗生素耐药率和敏感率见表2。

表2 鲍曼不动杆菌对4种氨基糖苷类抗生素耐药率和敏感率（%）Table 2.Susceptibility of Acinetobacterbaumannii isolates to aminoglycosides（%）

二、16S r RNA甲基化酶基因的检测

56株菌株中共有25株对氨基糖苷类抗生素耐药，25株中armA基因阳性者为21株，占耐药株84.0%，未检测到rmtB菌株。将基因测序结果与GenBankarmA基因（注册号为AY220558）作BLAST分析，发现它们核苷酸的同源性为99%。

图1 PCR扩增armA基因产物电泳结果FIG.1.Electrophoretic analysis of arm A gene products of PCR amplification

讨 论

长期以来人们都认为16S r RNA甲基化酶仅限于环境菌株［8］。2002年日本学者 Yokoyama等［9］对1株分离自1997年的铜绿假单胞菌的研究中，发现其对阿贝卡星高度耐药。阿贝卡星是卡那霉素的衍生物，1990年开始在日本上市，对氨基糖苷钝化酶稳定，仅可为甲氧西林耐药金葡菌（MRSA）产生的双功能酶［AAC（6′）／APH（2″）］水解失活，但通常表现为低水平耐药，说明还可能存在其他耐药机制。进一步研究发现，介导铜绿假单胞菌对阿贝卡星高度耐药的是一种新的氨基糖苷类抗生素耐药机制——16S r RNA甲基化酶（rmtA），并且该酶的编码基因和超广谱β内酰胺酶CTX-M-3编码基因位于同一接合性质粒上［9］。此后不断有新的16S r RNA甲基化酶在临床致病革兰阴性菌中被发现。2003年法国学者Galimand等［7］报道，从肺炎克雷伯菌中发现了另一种对多种氨基糖苷类抗生素耐药的16S r RNA甲基化酶armA。2004年日本，另一16S r RNA甲基化酶amtB从黏质沙雷菌中克隆得到。

本实验采用PCR方法检测2种16S r RNA甲基化酶基因arm A和rmt B。从56株鲍曼不动杆菌中检测到21株arm A基因阳性菌，阳性率为37.5%（21／56）。潘韵峰等［10］调查国内6个省市（北京、上海、重庆、沈阳、广州、浙江）25所医院鲍曼不动杆菌菌株中，23所医院检测到armA基因，阳性率达47.7%。朱健铭等［11］报道armA基因在浙江地区的流行，阳性率达30.0%，低于本研究结果。我国大陆地区armA基因检测阳性率远高于世界平均水平。国内16S r RNA甲基化酶基因之所以阳性率高，可能与以下因素有关：①医院内及医院间的克隆播散已经成为我国鲍曼不动杆菌分离率不断上升、菌株不断增加的最主要原因［12］；②16S rRNA甲基化酶基因armA和rmtB可通过质粒介导播散导致革兰阴性杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药并造成临床耐药菌株的传播［13］；③由于临床上氨基糖苷类抗生素的不合理使用，加速了这种耐药基因的产生和传播。

表2显示，不携带armA基因的鲍曼不动杆菌对阿米卡星、链霉素、庆大霉素、奈替沙星的耐药率显著低于携带armA基因的鲍曼不动杆菌，说明16S r RNA甲基化酶基因armA可导致鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素的高度耐药。耐药鲍曼不动杆菌在近10年迅速成为少数最为难治的病原菌，具有很强的医院内流行特性。因此有必要及时监控鲍曼不动杆菌及其耐药特性，改进和加强医院内预防与控制感染的措施，避免及减少医务工作人员本身作为不应该的传播媒介。合理使用抗生素也是预防及减少医院条件致病菌感染及耐药性形成传播的重要管理对策。

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The prevalence of 16S r RNA methylase gene and drug resistance analysis inAcinetobacterbaumannii

HUShaochun，TONGXianli，LEIDansheng. （DepartmentofClinicalLaboratory，CancerHospital ofHubeiProvince，HubeiWuhan430079，China）

ObjectiveTo analyze the resistance ofA.baumanniito aminoglycoside antibiotics and investigate the prevalence of 16S r RNA methylase genearm Aandrmt B.MethodsClinical isolates ofA.baumanniiwere collected from patients in Cancer Hospital of Hubei Province from March 2009 to May 2010.The size of inhibitory zone of these strains was determined using Kirby-Bauer（K-B）method.The 16S r RNA methylase genesarmAandrmtBwere detected by PCR.The positive PCR-products were purified for sequencing analysis.ResultsThearm Agene was positive in 21（37.5%）of the 56A.baumanniistrains.However，rmtB-positive isolate was not identified.Thearm A-negative isolates were much less resistant than the correspondingarm A-positive strains.ConclusionsThe prevalence of aminoglycosides-resistantA.baumanniiis increasing in our hospital in recent years.The 16S r RNA methylase genearmAis widely present inA.baumanniiisolates.Such isolates are highly resistant to multiple antibiotics，which may become a clinical concern.

Acinetobacterbaumannii； 16S r RNA methylase gene； aminoglycoside； resistance

R378

A

1009-7708（2012）06-0446-03

湖北省肿瘤医院检验科，湖北 武汉 430079。

胡少春（1973—），女，主管技师，学士，主要从事细菌耐药机制研究。

胡少春，E-mail：334646547＠qq.com。

2012-04-01

·论著·