超滤技术在蛋白质分离纯化中的应用

王 健， 叶波平

(中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京210009)

超滤技术是一种以超滤膜作为分离介质，以膜两侧的压力差为驱动力，利用料液中各组分在高分子膜中传质的差异，对其进行分离、分级、纯化和浓缩的方法。在超滤过程中，所用超滤膜的孔径约为1～100 nm，截留相对分子质量(molecular weight cut off，MWCO)为3×105～1×106，能用于蛋白质、细菌、胶体、病毒、热原、多糖等的分离［1-2］。

超滤技术的核心部件是超滤膜，其结构及所用材料性质对膜的分离性能起着决定性作用。超滤膜大多数是由两层不同结构的薄层组成的非对称膜，其中，上层很薄，厚度为0.1～1.0μm，称作活化层，其孔径较小，起截留粒子的作用，决定膜的分离性能;下层较厚，厚度为100～200μm，孔径较大，称为支撑层，起增加膜强度的作用［3］。

根据材料的不同，超滤膜可分为有机膜和无机膜。一般而言，膜材料应具备良好的成膜性、机械稳定性、化学稳定性、热稳定性以及耐酸碱和耐微生物浸蚀等性能［4］，理想的膜材料还应具有亲水性［5］及不对蛋白质等生物大分子产生非特异性吸附作用［6］。常用的有机膜包括聚醚砜(PES)膜、聚丙烯(PAN)膜、再生纤维素(RC)膜、醋酸纤维素(CA)膜、聚砜(PS)膜、聚偏氟乙烯(PVDF)膜等，其中PES膜以高刚性、抗蠕变性、化学稳定性和生物稳定性等优点，常用作超滤的首选膜材料［7-8］。除有机膜外，无机陶瓷超滤膜也以耐高温、易清洗、耐酸碱、抗生物腐蚀等特点而开始被应用于制药工业和生物技术产业，这种膜是以氧化铝、氧化锆、氧化钛等为材料、采用特殊工艺制成的多孔非对称膜［6］。随着高分子材料以及成型加工工艺学的不断发展，不同形式的超滤膜组件应运而生，主要有中空纤维式、圆管式、板框式、卷式和毛细管式。

蛋白质分离纯化是一项富有挑战性的工作。由于蛋白质存在于复杂的生物体系中，且自身不稳定，遇热或遇某些溶剂易变性失活［9］，故传统的蒸馏、溶剂萃取等分离技术并不适用于其分离纯化，而色谱法用于蛋白质的分离纯化，虽具有高分辨率的特点，但操作繁琐、难放大、成本高，在工业化生产中的应用受到限制。与上述方法相比，超滤技术作为一种典型的膜分离技术，则具有高效率、低能耗、无相变、无需添加任何化学试剂、操作简便、条件温和等诸多优点，在蛋白质脱盐、脱醇、浓缩、分级分离及内毒素去除等过程中具有广阔的应用前景。

1 超滤技术的应用研究

1.1 用于蛋白质的脱盐、脱醇及浓缩

超滤技术现已逐渐替代空间排阻色谱，成为蛋白质脱盐、脱醇和浓缩富集的首选方法(Kurnik等，Biotechnol Bioeng，1995年)。近年来，该项技术已成功应用于干酪乳清和大豆乳清中高营养价值蛋白的脱盐和回收［10-14］。如:首先将干酪乳清用热钙法预处理，致使CaCl2与料液中的脂类物质形成絮状沉淀，以降低乳清浑浊度，提高膜的通透量［15］;然后将乳清和水按2∶1体积比稀释，再利用MWCO为1×104的板框式超滤装置，在操作压力为0.21 MPa、料液pH为6.0的条件下，有效脱除了乳清中的乳糖和盐类等小分子杂质(乳糖脱除率达93.13%)，并回收了α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白、牛血清白蛋白和乳铁蛋白等营养价值高的蛋白质(蛋白截留率达94.65%)［11］。

Chay Pak Ting等［16］分别利用 MWCO为1×104和3×104的PES膜，在操作压力0.14 MPa、料液pH为8.0及温度为50℃的条件下，对卵高磷蛋白(Mr=3.5×104)进行浓缩和脱盐，结果，目的蛋白分别浓缩了6.25和5.92倍，其粗提物得率分别为84.7%和84.4%。

利用超滤技术也可实现对血清中免疫球蛋白(Ig)的有效浓缩。IgG(Mr=1.6×105)的基本结构由两条轻链(Mr=2.4×104)和两条重链(Mr= 5.5×104)共4条肽链组成，罗磊等［17］选用MWCO为1×104的PES膜和螺旋卷式超滤设备，在操作压力为0.1 MPa、料液pH为7.5及温度为50℃的条件下，以截留液全循环错流方式对预处理猪血清中的IgG进行超滤浓缩，结果，料液中IgG的质量浓度从1.4 g·L-1浓缩至14.2 g·L-1。在超滤浓缩蛋白质的过程中，为保证目的蛋白的收率，一般建议选用MWCO小于目的蛋白相对分子质量的1/3的膜。

1.2 用于蛋白质的分级分离

蛋白质的分级分离是指根据料液中各蛋白质组分理化性质(如相对分子质量、等电点、疏水性等)的差异而将其逐段分开的过程。凝胶色谱是常用的生物大分子(尤其是蛋白质)分级分离方法之一，而与传统的色谱技术相比，超滤分离技术因具有低成本、易放大的特点，在一些具有重要经济价值的蛋白和酶类的分级分离及工业化生产中展现出良好的应用前景。

鸡蛋蛋清是获得溶菌酶和卵清蛋白最廉价的原料，近来人们常采用超滤法从鸡蛋蛋清中分离卵清蛋白和溶菌酶［18-19］。如:用200 mmol·L-1的NaCl溶液将鸡蛋蛋清适当稀释后，采用配有MWCO分别为3×104和5×104的PES膜的涡旋装置，对其中蛋白进行两步分离纯化:先用MWCO为3×104的PES膜去除小分子蛋白(Mr为1.27×104～2.80×104)，如卵类黏蛋白、溶菌酶、卵糖蛋白等，将大分子蛋白截留;再用MWCO为5×104的PES膜处理截留的大分子蛋白，将相对分子质量较大的蛋白(Mr为5×104～9×105)，如卵白素、卵转铁蛋白、卵黏蛋白、G3卵球蛋白等截留，而相对分子质量较小的卵清蛋白则透过膜，得以分离。期间，通过优化工艺条件:操作压力为0.44 MPa、搅拌转速为200 r·min-1、料液pH为2.5以及蛋清和水的体积比为1∶1，成功获得纯度为98.7%、得率为45%的卵清蛋白［18］。

Wang等［20］从大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD，Mr=2.7×104)时，发现粗酶液中主要存在6种蛋白质，随后选取与SOD分子质量最接近且对其纯度影响较大的两种杂蛋白作为研究对象，使用MWCO分别为1×105和5×104的RC膜和PES膜对粗酶液中蛋白质进行两步超滤分离，即首先采用RC膜将其中的大分子杂蛋白(IPA，Mr=1.53×105)截留，获得含SOD、小分子杂蛋白(IPB，Mr= 1.50×104)和另外3种杂蛋白的料液;然后调节料液pH、离子强度、流速和搅拌速度，用PES膜截留SOD而使IPB和其余小分子蛋白透过膜。结果，通过优化工艺条件:料液pH为8.0、不加NaCl、流速为26.5 L·m-2·h-1及搅拌速率为1 200 r·min-1，获得纯度为98%、得率为90%、比活力为3 011 U·mg-1的SOD。与传统的分步盐析法和有机溶剂沉淀法提取SOD工艺［21-22］相比，该工艺操作步骤简单、条件温和、无需添加化学试剂，且SOD得率分别提高了49%和37%，其比活力也较盐析法提高了3.1倍，但较有机溶剂法有所降低。

尽管超滤技术已成功应用于蛋白质的分离纯化，但值得注意的是:传统超滤技术的分离精度尚不高，要使蛋白质达到较好的分离效果，一般要求杂蛋白与目标蛋白的相对分子质量相差10倍以上［23］。

1.3 用于内毒素的去除

利用原核表达系统生产的药用蛋白常易混入由细菌细胞壁破壁后产生的内毒素，而内毒素又称热原，是一种脂多糖(LPS)，进入人体后可引起发热、微循环障碍、内毒素性休克等症状［24］，因而必须将其除去。

内毒素具有耐热性和化学稳定性，不易被灭除。早期用于去除重组蛋白药物中内毒素的方法主要有非离子型去垢剂Triton X-114萃取法(Liu等，Clin Biochem，1997年)、离子交换色谱法(Neidhardt等，JChromatogr A，1992年)和活性炭吸附法(Nagaki等，Int J Artif Organs，1991年)，其中，Triton X-114萃取法虽可有效去除蛋白质溶液中的内毒素，但残留的Triton X-114对人体有毒害;离子交换色谱法是通过阴离子交换剂的吸附作用而除去生理条件下带负电荷的内毒素，故不适用于处理带负电荷的蛋白;活性炭吸附法则易发生蛋白质的非特异性吸附，导致目标蛋白得率降低。超滤技术的发展则为重组蛋白药物中内毒素的去除提供了新的有效途径。内毒素单体(Mr为1×104～2×104)在水溶液中会形成聚集体(Mr为3×105～106)，且两者维持一个动态平衡［25］。Jang等［26］采用MWCO为1×105的超滤膜研究了料液中蛋白质量浓度对内毒素滤除效率的影响，结果发现，蛋白质量浓度为8.8 g·L-1时，内毒素去除率为37.9%，而随着蛋白质量浓度的降低，内毒素去除率逐渐升高，当蛋白质量浓度降至2 g·L-1时，内毒素去除率高达99.6%。这可能是由于在高质量浓度的蛋白质溶液中，内毒素与蛋白质的相互作用增强，导致其难以去除，而在低质量浓度的蛋白质溶液中，这种相互作用减弱，内毒素也就易于去除。

2 超滤技术应用中面临的问题及解决方法

超滤技术应用于蛋白质分离纯化，虽具有其独特优势，但超滤膜缺乏选择性以及在超滤过程中易产生浓差极化与膜污染等，已成为该项技术应用中亟待解决的难题。

2.1 超滤膜的选择性

已有研究显示，超滤膜缺乏选择性，即对相对分子质量相近的蛋白质组分不能进行有效的分离，可通过调节料液的理化参数(如pH和离子强度)以优化目的蛋白的理化性质、改进膜的组合形式及引入亲和技术以提高膜的分离性能而加以改善。

2.1.1 调节料液的理化参数 适当调节料液的pH值和离子强度，可改善目的蛋白的理化性质，致使其与其他组分的膜通透性产生差异，从而达到将其有效分离的目的。Wan等［27］使用MWCO为1×105的PES膜考察了料液pH和离子强度对人血清蛋白和Ig的膜通透性的影响，结果发现，当料液pH为4.7(即血清蛋白的等电点)时，血清蛋白的膜透过率达最大值79.50%，而Ig的膜透过率则较低，仅为27.68%;当料液中NaCl浓度较低(1.0～3.0 mmol·L-1)时，血清蛋白相对于Ig的筛分系数(即血清蛋白与Ig的透膜量比值)大于50，且NaCl浓度为1.5mmol·L-1时，二者筛分系数达330，获得最佳分离效果。据此，确定这两种蛋白的最佳分离条件:料液pH为4.7及NaCl浓度为1.5 mmol·L-1。

2.1.2 改进膜的组合形式 通过改进超滤膜的空间组合形式，可大大提高膜超滤分离时的分辨率。Yunos等［28］以单层超滤膜为参照，考察了两种“三明治”形式的超滤膜装置——两层PES膜的活化层均朝上的Sirkar装置和两层PES膜的活化层朝向相反且均朝外的Zydney装置对溶菌酶(Mr=1.43×104)和肌红蛋白(Mr=1.74×104)的分离效果。结果显示，与单层超滤膜相比，这种膜的“三明治”组合形式的优点在于，膜与膜贴紧，掩盖了膜上不均匀的大孔，优化了膜的孔径分布，致使膜超滤时的选择性大大提高，且膜污染也有所减轻;在pH 11.0的100 mmol·L-1Tris缓冲液中，采用Sarkar装置成功实现了相对分子质量相近的溶菌酶和肌红蛋白的分离;但是，Zydney装置易造成下层膜的破坏。

Mayani等［29］则评价了串联组合的连续多级超滤系统用于分离纯化鸡蛋蛋清中溶菌酶的可行性，期间，首先考察了连续三级串联超滤系统的分离纯化效率，将蛋清料液先经MWCO为5×104的一级超滤膜组件处理，分别获得含溶菌酶的渗出液和含大分子杂蛋白的残留液，前者再进入MWCO为3×103的二级超滤膜组件，即可从其残留液中获得纯化的溶菌酶，而后者则与经二级超滤膜组件处理所获渗出液一起进入MWCO为5×104的三级超滤膜组件，截留大分子蛋白混合物，渗出液进入一级超滤膜组件，回收其中少量的溶菌酶。结果，采用连续三级串联超滤系统获得的溶菌酶纯度为96%、得率为75%，分离纯化效果明显。但经此三级串联超滤系统处理所获溶菌酶稀释严重，致使缓冲液未能得到充分利用，于是该研究小组考虑在此系统基础上添加一级浓缩步骤，从而建立了连续四级串联超滤系统。实验显示，采用该四级串联超滤系统处理蛋清料液，不但可获得高纯度(97%)的溶菌酶，而且使酶浓度提高了2倍，同时实现了溶菌酶的纯化和浓缩，简化了后续操作工艺，缩短了生产周期，并可循环利用缓冲液，降低了生产成本。因此，连续四级串联超滤系统在蛋白质大规模分离纯化中更具应用前景。

2.1.3 引入亲和技术 将亲和技术的高选择性与超滤技术的高分离能力相结合而形成的新型亲和超滤技术(affinity ultrafiltration)可提高超滤膜对特定蛋白分离的选择性而将目的蛋白纯度提高1 000倍［30］。亲和超滤技术的基本原理是:将可特异性结合目的蛋白的配基与载体(如葡聚糖、壳聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖、脂质体、聚苯乙烯等)偶联，再与目的蛋白粗提液混合，致使配基偶联体特异性地与目的蛋白给合，形成体积和相对分子质量远大于杂蛋白的复合物;于是，在后续的超滤过程中，复合物被滤膜截留，杂质则透过膜而被除去;最后，选用合适的洗脱液将截留的复合物上结合的目的蛋白洗脱下来，从而获得分离纯化的蛋白产品。

亲和超滤的成败取决于大分子配基的制备以及洗脱液把目的蛋白从复合物上洗脱下来的能力。若配基与目的蛋白的结合力太弱，会影响分离纯化效率，而二者结合力太强，则不易将目的蛋白从复合物上洗脱下来，所以在应用亲和超滤技术时一般选用具中度亲和力的配基为宜。目前，亲和超滤技术已成功应用于磷脂酶A2(PLA2)、胰蛋白酶、凝血酶等多种酶的分离纯化。

PLA2是一种 Ca2+依赖型脂肪水解酶，可在Ca2+的存在下，与磷酸甘油类物质(如磷脂酰乙醇胺)的sn-2位点结合而发挥水解作用。Teke等［30］将大分子水溶性壳聚糖与磷脂酰乙醇胺偶联，制得亲和载体，再将亲和载体和PLA2粗提液混合，并在4℃下用10 mmol·L-1CaCl2溶液预处理2 h，用MWCO为1×105的超滤膜将未结合蛋白质去除，而截留PLA2与大分子亲和载体结合所形成的复合物;然后，用50 mmol·L-1EDTA溶液处理复合物，将Ca2+螯合，致使PLA2从复合物上洗脱下来，在4℃下经透析除盐及MWCO为3×104的超滤膜超滤浓缩，最终获得浓缩79倍、得率为76.3%的PLA2;经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示，所获PLA2的Mr为1.6×104。

胰蛋白酶是一种源于动物、专一性水解赖氨酸与精氨酸羧基形成的肽键的蛋白水解酶，广泛用于生物制药和食品行业。Luong等(Biotechnol Bioeng，1988年)用N-丙烯酰-间-氨基苯甲脒和丙烯酰胺共聚物制成水溶性大分子亲和载体，再将亲和载体和胰蛋白酶粗提液混合，并在4℃下孵育2 h，致使亲和载体上N-丙烯酰-间-氨基苯甲脒与胰蛋白酶特异性结合而形成大分子复合物，用MWCO为1×105的超滤膜截留复合物而除去其他杂质;然后，使用精氨酸或间-氨基苯甲脒将胰蛋白酶从复合物上洗脱下来，通过超滤将载体和酶分开，经浓缩除盐后获得得率达90%以上、纯度为98%的胰蛋白酶。

凝血酶是一种催化血液中纤维蛋白原转变为纤维蛋白、加速血液凝固而发挥止血作用的蛋白水解酶，临床上广泛用于局部止血和术后伤口愈合。Wang等［31］在PES膜上偶联肝素和导电聚合物多吡咯，制得用于分离纯化凝血酶的导电亲和膜(affinity electromembrane)。该膜的特点是，膜上肝素配基被多吡咯的侧链包裹，防止了配基的丢失，提高了膜的稳定性，且加以适当的电压可原位调节膜的转运性质。实验显示，该膜对凝血酶的吸附率高达93.1%;使用2 mol·L-1NaSCN溶液将凝血酶从膜上洗脱下来，再通过超滤去除洗脱剂，可获得纯度达98%以上的凝血酶;该膜的非特异性吸附少，稳定性高，重现性好;此外，利用该膜的截留作用还可有效去除原料药中可能存在的病毒。

基于抗体-抗原反应而发展起来的免疫亲和超滤技术则是将抗体或抗原固定到膜表面，利用抗原和抗体之间的特异性结合而实现目的蛋白高效分离的一种新技术。目前，该技术已成功应用于IgG的分离纯化［32］，但由于抗体的制备耗时、成本高以及抗体与膜的结合率低、易失活等，尚未见有关其工业化应用的报道。

2.2 浓差极化与膜污染

浓差极化是一种在超滤过程中，因料液中溶剂透过膜，使膜表面的溶质浓度增加，致膜表面形成“凝胶层”，从而对溶剂透过起着阻碍作用，导致传质推动力下降的现象(Matthiasson等，Desalination，1980年)。膜污染则是一种在超滤过程中，由于料液中胶体物质、微粒、微生物、溶质分子等吸附于膜表面或沉积在膜孔中，使膜孔堵塞或变小，导致膜阻力增大和膜的渗透速率下降的现象(Reihanian等，JMembr Sci，1983年)。研究表明，浓差极化和膜污染可通过优化膜表面的流体力学条件、外加物理场及选择合适的操作条件等措施以强化超滤过程而得到改善。

2.2.1 优化膜表面的流体力学条件 优化超滤膜表面的流体力学条件，包括提高料液流速、采用切向流过滤和设计合理的膜组件流道结构等。实验显示，在超滤过程中，料液流速越大，其在膜表面的剪切力越大，大分子组分扩散越快，膜表面沉积层厚度减小，从而有效减轻浓差极化［33］;切向流过滤是指料液的流动方向与过滤方向成垂直的过滤方式，此时，料液在膜表面产生剪切力，加快了其在膜表面的流速，避免了浓差极化的形成［34］;此外，设计合理的膜组件流道结构，可避免流道产生死角，使被截留物质及时被带走，也保证了流体处于湍流状态，从而防止膜表面“凝胶层”的产生，也减轻了膜污染。

2.2.2 外加物理场 外加物理场(如电场、超声场等)强化超滤的原理是:在电场作用下，料液中带电荷粒子发生垂直于膜表面并与介质渗透方向相反的电泳迁移，使膜表面边界层厚度降低，同时，溶剂发生电渗效应，促进其加速透过膜，从而减轻浓差极化和膜污染，提高膜通量;在超声波作用下，可产生声冲流、空化和热效应，从而减轻浓差极化，增加膜通量。

肖凯军等［35］以牛血清蛋白(BSA，Mr=6.7×104)为分离对象及膜通量、截留率、膜通量衰减程度和恢复率等参数为指标，考察了在操作压力为0.2 MPa、料液pH为6.8及温度为25℃的条件下，外加直流电场对γ-Al2O3陶瓷超滤膜分离性能的影响。结果显示，无外加电场超滤时，膜通量在40 min内衰减至原始值的59.4%，膜阻力明显增加;而外加正电场(20 V·cm-1)后，膜通量在20 min内逐渐升高并达到一个相对稳定的高值，较无外加电场时提高了1.67倍，且维持60 min未见衰减，同时截留率也从28.7%提高到46.8%，超滤强化效果明显;但外加负电场时，则由于浓差极化和膜污染的加剧，导致膜通量降低(见图1);另外，采用外加电场技术，可使受污染的陶瓷膜的膜通量在短时间内(20 min)恢复至原始值的95%以上。

图1 外加不同电场时超滤膜的膜通量－时间曲线Figure 1 Membrane flux-time curves ofultrafiltrationmembrane in different electric fields

Cai等［36］以葡聚糖(Mr为105～2×105)为分离对象，采用MWCO为3×104的PES膜考察了不同超声频率和操作压力对超滤的强化作用。结果发现，在操作压力为0.4 MPa、温度为25℃的条件下，当超声频率为28和45 kHz时，膜通量显著提高，膜污染明显减轻，而超声频率达100 kHz时，则无明显超滤强化效应，这可能是由于高超声频率在料液中产生的空化作用减弱所致;在操作压力为0.4 MPa时，28 kHz超声频率产生的超滤强化作用明显强于45 kHz(见图2)，而当操作压力增加至1.2 MPa时，这两个超声频率产生的超滤强化效果基本相同。然而，超声场虽能显著提高超滤效率，其产生的热效应却会导致料液温度过快升高，从而造成蛋白生物活性损失。

图2 外加不同超声频率时超滤膜的膜通量－时间曲线Figure 2 Membrane flux-time curves ofultrafiltrationmembrane using different ultrasonic frequencies

2.2.3 选择合适的操作条件 采用超滤技术分离纯化蛋白质时，选择适当的操作压力、料液pH值及温度，有助于减轻浓差极化和膜污染。实验显示，在超滤过程中，综合考虑目的蛋白和膜材料的热稳定性，适当提高料液温度，降低其黏度，可增大其扩散系数，提高膜通量［19］;而适当调节料液pH值，使其远离目的蛋白等电点，可避免蛋白形成沉淀，减少蛋白在膜上的吸附，或使目的蛋白与膜所带电荷相同，利用同种电荷相斥的原理而减弱膜对蛋白的吸附作用［19，27］;适当提高操作压力则可致料液流速增加，从而增加膜通量，但当膜表面蛋白浓度达到饱和时，若继续增加压力，将加剧浓差极化，导致膜表面形成“凝胶层”，从而使膜的通透性降低，影响其分离性能，因此，通常选用在膜表面“凝胶层”刚开始形成时所对应的操作压力为宜(Reihanian等，J Membr Sci，1983年)。

3 展望

随着生物工程产业的不断发展，超滤技术将以其独特优势而逐渐取代传统的浓缩、透析、离心、沉淀等方法，广泛应用于蛋白质的分离纯化。但是，在用于蛋白质分离纯化以及工业化生产时，该项技术尚有不够完善之处，因此对其的研究将会集中在以下几个方面:1)加强对超滤膜的研究，开发性能好、稳定性高和耐污染的膜材料;2)研发自动化和集成化程度高的超滤设备，以缩短生产周期和降低生产成本;3)通过安装辅助部件或改进流道结构，开发低能耗、低污染的膜组件;4)进一步开展超滤工艺优化研究，提高超滤的效率和分辨率;5)深化超滤技术与其他新技术(如亲和技术、物理场技术等)整合应用的研究，开拓超滤技术的应用空间。

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