重组腺病毒Ad－HGF－hIL10基因治疗大鼠肝纤维化

邱 红，邢继成，朱月蓉，王 冰

(南京解放军第八一医院生化科，江苏南京210002)

重组腺病毒Ad－HGF－hIL10基因治疗大鼠肝纤维化

邱 红*，邢继成，朱月蓉，王 冰

(南京解放军第八一医院生化科，江苏南京210002)

目的 探讨人IL-10和HGF双表达的重组腺病毒hIL10-HGF对大鼠肝纤维化的治疗效果，以期为肝纤维化的基因治疗提供实验基础。方法 建立SD大鼠肝纤维化模型后，将1.5×108PFU的Ad-HGF、Ad-hIL10和Ad-HGF-hIL10经尾静脉注射入大鼠体内，模型组和对照组注射同剂量的0.9%氯化钠注射液。第15天心脏采血，检测血清的肝功能指标，并取肝组织做HE染色，观察各组大鼠肝脏的病理形态。结果 与模型组大鼠相比，治疗组大鼠的肝组织损伤程度减轻，汇管区看不到明显的纤维增生。各治疗组的TBIL、ALT、AST显著低于模型组(P＜0.01)，而ALB显著升高(P＜0.01)，肝功能得到了明显的改善，而Ad-HGF-hIL10双基因治疗组与Ad-HGF、Ad-hIL-10单基因治疗组相比，ALT、AST显著降低(P＜0.05)，白球比(0.83±0.11)与其他两个单基因治疗组Ad-HGF(0.74±0.05)和Ad-hIL-10(0.73±0.05)相比显著上升(P＜0.01)。结论 用HGF和hIL-10双基因的腺病毒载体治疗大鼠肝纤维化，肝功能的改善效果明显优于单基因治疗组。

肝纤维化;腺病毒;肝细胞生长因子;白细胞介素10;基因治疗

肝炎、肝炎后肝硬化和肝癌严重危害人类健康，而绝大多数晚期病例尚缺乏有效治疗手段。通过基因治疗手段来预防和减轻肝损伤是近年来人们研究的一个新方向。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)被认为是最强的肝再生促进剂，是一种具有多功能的生物大分子，它有强效的抗肝炎、促肝再生作用［1］。IL-10是一个多效性细胞因子，具有广泛的生物学作用。研究表明内源性IL-10对肝细胞具有保护作用，而且给予外源性IL-10也显示了明显的抗肝细胞损伤作用［2－3］。本研究将重组腺病毒通过尾静脉注射入肝纤维化模型大鼠体内，研究其对大鼠肝纤维化的治疗作用，以期为肝硬化的基因治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:清洁级雄性SD大鼠85只，8～10周，体质量234～285 g，购自浙江省实验动物中心南京代理处［SCXK(浙)20080033］。

1.1.2 质粒、药物和试剂:携带人肝细胞生长因子和白细胞介素-10基因的重组腺病毒Ad-HGF、AdhIL10和Ad-HGF-hIL10均由本实验室构建［4］，苯巴比妥钠(100 mg/支)(上海新亚药业有限公司)，四氯化碳(AR)(南京晟为诺生物科技有限公司)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(烟台澳斯邦生物工程有限公司)，总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)试剂盒(南京澳林生物科技有限公司)，总胆红素(TBIL)试剂盒(日本和光纯药工业株式会社)，福临门葵花籽油，食用白酒(乙醇体积分数52%)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备及分组:随机抽取14只大鼠作为正常对照组，71只大鼠作为模型组，采用四氯化碳(CCl4)诱导法制备肝纤维化模型。模型制备分为两期:诱导期和成模期。诱导期:实验动物在诱导前以苯巴比妥钠(350 mg/L)溶液作为大鼠的唯一用水，时间为1周，饲料使用普通大鼠饲料。成模期:实验组:按0.5 mL/100 g剂量予以腹腔注射50%CCl4中性菜籽油溶液，每周2次连续4周，同时以10%乙醇水(由上述食用白酒加蒸馏水配制)为其唯一用水。第5周开始改为30%乙醇溶液为其唯一用水至实验结束。对照组按0.3 mL/100 g予以腹腔注射0.9%氯化钠注射液，每周2次，给予普通饮水和饲料，频度及剂量同实验组。时间共计10周，末次给药后7 d，随机取模型组和对照组各3只大鼠，心脏采血取血清检测 ALT、AST、TP、ALB 和TBIL，取肝组织做HE染色的石蜡切片，观察大鼠肝脏病理形态变化。

1.2.2 Ad-HGF、Ad-hIL10和 Ad-HGF-hIL10对肝纤维化的治疗作用:随机抽取肝硬化大鼠60只随机分为4组，每组15只，分别为Ad-HGF治疗组、Ad-hIL10治疗组、Ad-HGF-hIL10治疗组和模型组;对照组11只。治疗组大鼠通过尾静脉分别注射Ad-HGF、AdhIL10、Ad-HGF-hIL10 各300 μL 5 ×108PFU/mL，同样方法给模型组和对照组注射同剂量的0.9%氯化钠注射液，隔两日给药1次，给药15 d后，采集所有大鼠的心脏血，分离血清，在日立7600生化仪上检测 ALT、AST、TP、ALB 和 TBIL，并取肝组织做 HE 染色，观察5组大鼠肝脏的病理形态。

1.3 统计学分析

数据以均数 ±标准差(±s)表示，采用SPSS12.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1 大鼠肝纤维化模型的制备

成模61只，成模率85.9%。模型组大鼠的ALT、AST和TBIL高于正常，TP、ALB低于正常。肝脏病理学检查:模型组大鼠的肝脏明显肿大，边缘钝，质韧;在光镜下可见有细胞空泡坏死，有较多的中性粒细胞和淋巴细胞浸润，汇管区成纤维细胞增多，纤维组织增生(图1B)，对照组大鼠则无上述病变(图1A)。

2.2 各组大鼠血清肝功能指标

图1 肝纤维化大鼠肝脏形态学改变Fig 1 Morphological changing of hepatic fibrosis(×400)

模型组与对照组比较，TBIL、ALT、AST明显升高，ALB明显降低(P＜0.01);治疗组中，各组的TBIL、ALT、AST比模型组明显降低(P＜0.01)，ALB显著升高(P＜0.01);Ad-HGF-hIL10治疗组与Ad-HGF、Ad-hIL-10治疗组相比，ALT、AST 显著降低(P＜0.05)，Ad-HGF-hIL10治疗组的白球比与其他两个单基因治疗组相比显著上升(P＜0.01)(表1)。

2.3 病理学变化

与模型组大鼠相比，治疗组大鼠的肝细胞空泡变性程度减轻，数量减少;未见有中性粒细胞浸润，仅见少量的淋巴细胞;肝细胞水肿吸收，炎性反应明显好转，纤维组织减少(图2)。

3 讨论

图2 各组大鼠治疗后的肝脏形态学变化Fig 2 Morphological changing of rats'liver after therapy(×400)

肝细胞生长因子是一种具有多种生物学作用的实效分子，具有促有丝分裂、动力产生、细胞成形和肿瘤抑制等多种活性，同时也能刺激蛋白质的合成，实验表明［5－6］，HGF是肝细胞生长和 DNA 合成最强大的刺激剂，HGF通过旁分泌和自分泌机制启动肝脏再生，刺激肝细胞的生长。在肝纤维化的过程中，HGF主要通过抑制肝成纤维细胞的生长和信号传导，从而发挥抗肝纤维化的作用。

人IL-10主要通过具有高度亲和力的IL-10受体发挥作用，其生物学作用广泛，主要作用为抑制炎性反应和抑制多种基因转录。研究发现IL-10在控制局部炎性反应特性上对肝脏起保护作用，并通过抑制炎性介质的释放、核因子κB活性等途径阻止肝纤维化的发生和发展，它可通过抑制HSC的功能及促进HSC发生凋亡而发挥抗纤维化作用，还可直接减少胶原形成及增加胶原酶，在肝ECM重建中发挥重要角色，另外，IL-10通过减少TGF-β1分泌而间接限制纤维化形成，具有潜在的强大抗肝纤维化作用［7］。目前多项研究结果已证实，HGF和IL-10有望成为抗肝纤维化治疗的新靶点，但各项研究均集中于两者各自的抗纤维化作用，将两者基因融合后的抗肝纤维化研究尚未见报道。

表1 各组的肝功能指标Table 1 Liver function index of different groups(x— ±s)

本研究结果显示，给予 Ad-HGF、AdIL-10、Ad-HGF-hIL10治疗均使已形成肝纤维化的大鼠肝脏病变显著改善，无论从汇管区成纤维细胞的数量和纤维组织的层次还是退行性变的肝细胞数量和程度都可以看到纤维化程度的明显减轻。各治疗组的肝功能指标与模型组相比，TBIL、ALT、AST明显降低，ALB显著升高，说明肝功能得到了明显的改善，而Ad-HGF-hIL10双基因治疗组与Ad-HGF、Ad-hIL-10单基因治疗组相比，ALT、AST显著降低，白球比与其他两个单基因治疗组相比显著上升，肝功能的改善效果明显优于单基因治疗组。表明用双基因的腺病毒载体治疗肝纤维化大鼠，HGF和hIL-10在大鼠肝纤维化的改善过程中发挥了协同作用。除此之外，γ-干扰素(γ-IFN)、转化生长因子-β1(TGF-β1)抗体、转化生长因子-α(TGF-α)抗体等细胞因子也被证实具有抗肝纤维化作用［8－9］，探索多基因联合和寻找新的目的基因治疗肝纤维化预期将获得更为显著的临床效果。

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Gene therapy for rat hepatic fibrosis with recombinant adenovirus vector carrying HGF and hIL10

QIU Hong*，XING Ji-cheng，ZHU Yue-rong，WANG Bing

(Dept．of Biochemistry，PLA 81 Hospital，Nanjing 210002，China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of the recombinant adenovirus vector carrying hepatocyte growth factor(HGF)and human interleukin-10(hIL10)，Ad-HGF-hIL10，on CCl4-induced hepatic fibrosis in rats．MethodsHepatic fibrosis model was established with CCl4in SD rats，and a total of 58 rats were randomly divided into 4 groups．Ad-HGF-hIL10，Ad-HGF and Ad-hIL10 were injected into the tail vein of three testing groups respectively．Control group were injected with physiological saline．On the 15th day，blood samples were collected from rat heart，serum TBIL，ALT，AST，TP and ALB were measured．Liver biopsies were performed and microscoped．ResultsCompared with the model group，liver function of rats in the therapy group was obviously improved，while there is no obvious fibroplasia in the portal area．Compared with model group，the TBIL，ALT and AST level of the therapy group were obviously decreased(P＜0.01)and ALB level of the therapy group was obviously increased(P＜0.01)．The ALT and AST level of the Ad-HGF-hIL10 therapy group were much lower than that of the Ad-HGF and Ad-hIL10 therapy group(P＜0.05)，while the A/G value of the Ad-HGF-hIL10 therapy group is more higher than the Ad-HGF and Ad-hIL10 therapy groups(P＜0.01)．ConclusionsThe double-gene therapy group has better therapeutic effect than other single-gene therapy groups．

hepatic fibrosis;adenovirus;hepatocyte growth factor;interleukin-10;gene therapy

Q 784

A

1001-6325(2012)09-1049-04

2011－11－02

2011－12－09

南京军区医学科技创新经费(07M041)

*通信作者(corresponding author):mapleqh@126．com