高效制备人诱导多能干细胞并诱导分化为心肌细胞

方月琴，郭娟宁，孙晓明，侯一平，顾 准

(1.江苏健雄职业技术学院生物与化学工程系，江苏苏州215411;2.新加坡国家心脏中心研发部门，新加坡168752;3.新乡医学院法医学系，河南新乡453003;4.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都610041)

高效制备人诱导多能干细胞并诱导分化为心肌细胞

方月琴1，2，郭娟宁3，孙晓明2，侯一平4，顾 准1*

(1.江苏健雄职业技术学院生物与化学工程系，江苏苏州215411;2.新加坡国家心脏中心研发部门，新加坡168752;3.新乡医学院法医学系，河南新乡453003;4.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都610041)

目的 提高人诱导性多能干细胞(hiPSC)转化效率，缩短其产生周期，并避免引入异源基因。方法 利用GP2-293反转录病毒包装系统对人包皮成纤维细胞(HFFs)进行转化，引入小分子物质，并对类胚胎干细胞(ESC)克隆进行独立培养，检测标记蛋白，定向诱导分化能力和核型分析。结果 HFFs经转化后，20 d出现形态与ESC克隆相似的hiPSC，比经典法缩短了10 d，效率提高约12倍。它们与ESC同样表达标记蛋白;体外成功定向分化为心肌细胞。核型分析表明该hiPSC染色体核型正常。结论 建立稳定的转化效率高、周期短的hiPSC生成体系，并成功诱导分化成心肌细胞，为心血管疾病的模型构建和临床研究提供实验基础。

诱导性多能干细胞;转化效率;形成周期;心肌细胞;分化

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)是体细胞经过转化因子重编程得到的、与胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)具有相似的形态、功能特性的多能干细胞［1－2］，是疾病模型研究的良好载体，并为临床进行自体干细胞移植提供选择［3］。本实验采用 GP2-293细胞包装OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC4种因子的反转录病毒感染体细胞，在转化过程中加入 SB431542、PD0325901和Thiazovivin 3种小分子物质，以建立快速、高效iPSC诱导方法，并探讨其在体外定向诱导分化为心肌细胞的潜能，为构建心血管疾病模型以及自体干细胞临床治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

HFFs(新生儿包皮来源)(ATCC公司);GP2-293细胞(Clontech公司);小鼠胚胎成纤维细胞MEF(Chemicon公司);所有细胞培养基(Invitrogen公司)。上述细胞培养基成分为DMEM中含10%胎牛血清和1×L-谷氨酰胺。聚凝胺和丝裂霉素C(Sigma公司)，qRT-PCR试剂盒和细胞转染试剂盒(Clontech公司)，SB431542、PD0325901和 Thiazovivin(Stemgent公司)。

人胚胎干细胞hESC9(WiCell)，培养基为hESC培养液(DMEM:F12，20%KOSR，1×非必需氨基酸，1 × L-谷氨酰胺，0.11 mol/L 2-巯基乙醇，10 μg/L重组碱性成纤维生长因子bFGF)。

1.2 质粒

质 粒 pMXs-OCT4、pMXs-SOX2、pMXs-KLF4、pMXs-C-MYC(Addgene公司);pMXs-GFP的准备:以eGFP质粒(新加坡科学研究院试验性治疗中心Dr.William Sun实验室提供)为PCR模板，设计引物eGFP前引物:5'-CGGGAATTCGCCCTTCACCATGGT GAGCAAGGGCGAGGA-3';eGFP后引物:5'-CCGG AATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3'，引物两端引入EcoRⅠ酶切位点;PCR产物经EcoRⅠ酶进行酶切;同时用该酶切除pMXs-OCT4中OCT4基因以获得pMXs空载体，再将两者进行连接、转化。经酶切鉴定片段插入、测序明确序列及方向后，得到pMXs-GFP。大量抽提质粒于－20℃保存备用。

1.3 人诱导性多能干细胞(human induced pluri-potent stem cells，hiPSC)生成过程

先准备OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC4种转化因子的反转录病毒。在6 cm细胞培养皿上培养1×106个 GP2-293细胞，第 2天观察细胞，到达70%～80%汇合时利用磷酸钙法细胞转染试剂盒进行转染，次日早上换液。同时在 6孔板上培养105/孔人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast cells，HFFs)(0 d)。转染48 h后收集GP2-293细胞上清液，经0.45 μm过滤器进行过滤，留200 μL作病毒滴度检测(反转录病毒qRT-PCR滴度检测试剂盒);混合4种病毒液，加入终浓度为8 μg/L的聚凝胺。在培养HFFs的6孔板每孔加入8 mL病毒混合液，感染8 h后吸去病毒液，换成2 mL新鲜10%胎牛血清培养液(1 d)。GP2-293细胞转染72 h后再次收集病毒，对HFFs进行2次感染，8 h后换成4 mL 10% 胎牛血清培养基(2 d)。5 d时对HFFs进行换液;同时先在6 cm培养皿加2 mL明胶，37℃ 5%CO2培养箱放置半小时以上，吸去明胶后，加丝裂霉素C处理过的饲养层细胞MEF，106/6 cm培养皿。6 d将病毒感染的HFFs经胰蛋白酶消化后转移到5 d准备的MEF上，105/6 cm培养皿，培养过夜。第2天将 MEF培养液换成 hESC培养液，其中含10 μg/L的 bFGF 和浓度分别为2 μmol/L SB431542、0.5 μmol/L PD0325901 和 0.5 μmol/L Thiazovivin的3种小分子物质。隔天换1次培养液直至13 d出现小细胞团后，换成不含小分子物质的hESC培养液，直至克隆足够大。21 d左右将形状类似hESC的克隆，用针头切下来后培养到铺有MEF的器官培养皿(organ culture dish，OCD)上，1个克隆转移至1个OCD，分别标记。待克隆长大后再进行传代，同传统hESC培养。

1.4 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色和免疫细胞化学荧光染色

利用ALP测定试剂盒(Vector Laboratories公司)，根据说明书对iPSC和hESC克隆进行ALP染色。免疫细胞化学荧光染色操作:细胞在4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗涤2次，5%胎牛血清和0.1%Triton X-100室温封闭15 min，之后加入一抗，4℃孵育过夜。一抗有抗OCT4(1∶50，Abcam公司)，SSEA4(1∶500，Chemicon 公 司)，TRA-1-81(1∶100，Santa Cruz公司)和 TRA-1-60(1∶100，Santa Cruz公司)。之后PBS清洗2次，加入二抗室温孵育1 h。二抗为 Alexa flour 555-标记抗小鼠 IgG(1∶1 000，Invitrogen 公司)。胞核染色是 DAPI(1∶1 000，Invitrogen 公司)。

1.5 拟胚体(embryonic body，EB)形成与诱导分化成心肌细胞

将iPS克隆在10 cm培养皿中进行扩大培养，至85%～90%汇合，转移至6孔低黏附板上进行拟胚体(EB)形成。培养液为EB20培养液(DMEM:F12中含20% 胎牛血清，1×非必需氨基酸，1×L-谷氨酰胺，0.11 mmol/L 2-巯基乙醇)。一般2个10 cm培养皿中85%～90%汇合的iPSC可以转移至一个6孔板上。37℃培养过夜后，将EB20培养液换成CARM心肌细胞诱导培养液(DMEM中含1×ST混合液，1×非必需氨基酸，1×L-谷氨酰胺，0.11 mmol/L 2-巯基乙醇)，1～2周内出现搏动的心肌细胞团。

将搏动的心肌细胞团从6孔板中小心取出，培养于经明胶处理过的多电极阵列(multi-electrode array，MEA)中央，待其附着固定后，用MEA信号记录仪对心肌细胞生理信号进行记录。

1.6 染色体核型分析

将待分析的iPSC细胞系R1.9、R1.15和hESC培养于铺有MEF的6 cm细胞培养皿上，待50% ～90%汇合时，交由新加坡KK医院产前筛查实验室分析。

2 结果

2.1 pMXs-GFP质粒的构建

pMXs-GFP质粒转染进入GP2-293细胞后，荧光倒置显微镜下观察显绿色荧光，转染效率在80%左右。

经pMXs-GFP病毒感染的人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast cells，HFFs)，感染病毒3 d后荧光下可见80%以上HFFs都携带GFP。

2.2 反转录病毒滴度测定

按照反转录病毒qRT-PCR滴度检测试剂盒操作说明，所得数据进行标准曲线分析R2=0.9991。根据所得方程式计算4种病毒量，发现每种病毒滴度接近，约为2×109copies/mL。在进行感染时，6孔板中每种病毒加入相同的量，为2 mL/孔。

2.3 从HFFs制备hiPSC

iPSC制备过程和时间表如图1A所示。一个6cm细胞培养皿培养1×105病毒感染HFFs，21 d时约出现30个左右类似hESC的克隆，效率比经典方法高12倍。同时，iPSC形成周期从30 d缩短到20 d，节约了工作时间。

在MEF饲养层细胞上，iPSC与hESC克隆形态形态相似(图1B)，呈圆形或椭圆形，与MEF之间有明显而清晰的边界，克隆内细胞排列有序而紧密。一般7 d传代。

2.4 ALP与免疫荧光染色结果

除ALP之外，其他干细胞特征性标志也做了检测。由图2可知R1.9与hESC同样都表达了这些干细胞标志性蛋白质。

2.5 hiPCS和hESC体外诱导分化成的心肌细胞

iPSC和hESC首先悬浮培养成球形EB，然后经过2周左右诱导分化，形成具有节律性搏动的心肌细胞团块，形态如图2A所示。将心肌细胞团置于MEA上记录心肌电生理情况 (图2B)，从hESC分化得到的心肌细胞两次搏动之间间隔为826 ms，幅度为119 μV，心率为73次/min;从hiPS稳定细胞系R1.19分化得到的心肌细胞两次搏动之间间隔为820 ms，幅度为117 μV，心率为70次/min。

2.6 核型分析结果

hESC购自美国威斯康星国际干细胞库，核型为46，XX;iPSC 来源细胞是 HFFs，核型为 46，XY。新加坡KK妇女与儿童医院产前筛查实验室检测结果均为正常核型，并与预期相符。

3 讨论

体细胞经4种转录因子作用可转变为iPSC，它们不但拥有正常核型，还具有与ESC相似的细胞表面标记及向3个胚层细胞发育的潜能［1］，从而在一定程度上规避了hESC运用所引起的伦理学问题［2］。近年来全球掀起了iPS研究高潮，从iPS产生机制和疾病相关iPS方面展开了广泛而深刻的研究，以期早日为临床医学服务［4－5］。

图1 iPSC的制备过程和iPSC与hESC克隆标记物鉴定Fig 1 Induction process for iPSC and specific markers detection

iPSC最早是利用PLAT-E细胞制备反转录病毒，向成体细胞中转入OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC4种转化因子获得［6］。但hiPSC转化效率低(10个iPS克隆/5×104HFFs)，所需周期长(30 d)，亟需提高转化效率并缩短实验周期。研究发现在转化过程中加入3种小分子化合物SB431542、PD0325901和Thiazovivin可大幅提高转化效率，并缩短重编程周期［7］。但是该过程需先将鼠Slc7a受体通过慢病毒转入HFFs，再用4种转录因子的反转录病毒，对携带Slc7a受体的HFFs进行转化。该过程需两步感染，虽提高了iPSC的转化效率，但同时引入了异源基因鼠Slc7a受体。

图2 hiPSC和hESC诱导分化为心肌细胞Fig 2 Cardiomyocytes from hESC and iPSC

本研究通过GP2-293细胞包装4种转化因子。GP2-293体系包装所得病毒能够直接感染人分裂期细胞，无需在人体细胞中导入鼠源基因Slc7a受体，也省略了慢病毒包装与感染过程。故可避免在目的细胞中引入异源基因，并在一定程度上降低了实验风险。

在HFFs向iPSC转化过程中，细胞形态、极性、细胞与细胞间关系都发生了巨大变化。此过程中，细胞开始表达上皮细胞标记蛋白，由此推测能够促进间质向上皮转化的因子可促进iPSC的生成，如TGFβ通道拮抗剂SB431542。此外，MEK通路是体细胞的细胞周期进程所必需的，而非ESC所需。研究也表明抑制MEK-ERK通路对于iPSC产生过程也有很重要的促进作用，而PD0325901为MEK抑制剂［8］。Thiazovivin是促细胞存活分子，以上3种物质合用能够提高转化效率，缩短 iPSC形成周期［7］。因此在本实验中也引入了这3种物质，提高了转化效率。

本研究建立了一种安全有效的iPSC制备方法，并体外诱导分化为心肌细胞。最近报道用较少的因子［9］即可获得转化，或是将体细胞直接诱导成心肌细胞［10］或神经细胞［1］，避开转化过程，为疾病模型构建和自体细胞治疗节约了时间。本研究将继续探讨用更优化的方法进行心血管疾病特异性iPS细胞系构建及自体细胞治疗的尝试。

［1］钟秉政，黄巧冰．把人体皮肤成纤维细胞重编程为干细胞［J］．基础医学与临床，2010，30:209－211．

［2］林真，沈晓丽．转导特定基因编程体细胞为多能干细胞［J］．基础医学与临床，2010，30:206－208．

［3］Park IH，Arora N，Huo HG，et al．Disease-specific induced pluripotent stem(iPS)cells［J］．Cell，2008，134:877－886．

［4］Freund C，Mummery CL．Prospects for pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in cardiac cell therapy and as disease models［J］．J．Cell Biochem，2009，107:592 －599．

［5］冯年花，谢安，娄远蕾，等．人诱导性多能干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究［J］．基础医学与临床，2010，30:1263 －1267．

［6］Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al．Induction of pluripotent stem ells from adult human fibroblasts by defined factors［J］．Cell，2007，131:861 －872．

［7］Lin T，Ambasudhan R，Yuan X，et al．A chemical platform for improved induction of human iPSCs［J］．Nat Methods，2009，6:805 －808．

［8］Shi Y，Do JT，Desponts C，et al．A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells［J］．Cell Stem Cell，2008，2:525 －528．

［9］Zhu SY，Li WL，Zhou HY，et al．Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds［J］．Cell Stem Cell，2010，7:651 －655．

［10］Ieda M，Fu JD，Delgado-Olguin P，et al．Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors［J］．Cell，2010，142:375 －386．

［11］Vierbuchen T，Ostermeier A，Pang ZP，et al．Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors［J］．Nature，2010，463:1035－1041．

Induction of human fibroblast cells to pluripotent stem cells and differentiation into cardiomyocytes

FANG Yue-qin1，2，GUO Juan-ning3，SUN Xiao-ming2，HOU Yi-ping4，GU Zhun1*

(1.Dept．of Biological and Chemical Engineering，Chien-Shiung Institute of Technology，Suzhou 215411;2.Research and Development Unit，National Heart Center，168752 Singapore;3.Dept．of Medical School，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003;4.Sichuan University，Chengdu 610041，China)

ObjectiveTo increase the transduction efficiency of hiPSC formation，decrease the time schedule and avoid the possibility of exogene introduction．MethodsHuman fibroblast cells were infected by retrovirus with four factors．During transduction，small molecules were added into hESC medium，until iPSC colonies grew big enough to be transferred．The stable iPSC colonies were detected by the expression of ESC protein markers，cardiomyocytes differentiation and karotyping analysis．ResultsThe reprogramming period was shortened by 10 days with 12 times higher efficiency．The iPSC shared similar protein expression level with hESC．Both iPSC and hESC were differentiated into cardiomyocytes successfully with similar MEA data and both showed normal karotyping results．ConclusionsThe established iPSC reprogramming system is efficient and time-saving for providing research model for cardiovascular disease modeling and clinical study．

induced pluripotent stem cells;transduction efficiency;time schedule;cardiomyocytes;differentiation

R 318.11

A

1001-6325(2012)09-1030-06

2011－06－13

2011－12－30

国家自然科学基金(81072510);河南省教育厅课题(2008A340001)

*通信作者(corresponding author):yueqinfang@yahoo．com．cn

志谢:感谢新加坡科学研究院试验性治疗中心William Sun博士提供eGFP质粒。