大鼠脑出血后V1αR和AQP4表达升高与脑水肿的形成相关

张 波，孙善全，甘胜伟，钟小燕，伍修宇，徐 进，黄 娟

(重庆医科大学神经科学研究中心，重庆400016)

大鼠脑出血后V1αR和AQP4表达升高与脑水肿的形成相关

张 波，孙善全*，甘胜伟，钟小燕，伍修宇，徐 进，黄 娟

(重庆医科大学神经科学研究中心，重庆400016)

目的 研究精氨酸加压素1α受体(V1αR)和水通道蛋白4(AQP4)在SD大鼠脑出血(ICH)脑组织中的表达变化及两者在脑水肿形成中的作用。方法 将自体血注入大鼠尾状核建立脑出血模型，分别于术后6、12、24和48 h运用干湿重法、免疫荧光和Western blot检测脑含水量(BWC)、V1αR和AQP4蛋白的表达。结果 脑出血后6 h，V1αR和AQP4的表达开始增加，至48 h达到高峰，分别为21.88±0.44和23.16±0.67，显著高于假手术组(14.32±0.55和13.90±0.40)，与脑含水量呈正相关(P＜0.05)。结论 V1αR介导的AQP4表达升高是脑出血后脑水肿形成的主要原因。

精氨酸加压素;V1α受体;水通道蛋白4;脑水肿

精氨酸加压素 (arginine-vasopressin，AVP)是一种可以维持水及电解质平衡的神经内分泌肽，主要由视上核和室旁核分泌［1］。研究发现，AVP可在多种神经系统疾病，如脑外伤和脑缺血的情况下促进脑水肿的形成［2－3］。AVP的这种作用可能是与其受体V1αR结合后，通过调节水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)所介导的水分子转运而实现的。本实验研究脑出血后V1αR和AQP4在脑组织的表达规律，以明确二者在出血性脑水肿形成中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:清洁级雄性SD大鼠120只，体质量200～250 g，由重庆医科大学动物实验中心提供，许可证号:SCXK(渝)2007-0001。

1.1.2 主要试剂和药物:小鼠抗大鼠AQP4单克隆抗体和兔抗大鼠V1αR多克隆抗体(Santa Cruz公司)，FITC标记山羊抗小鼠IgG和TRITC标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)，HRP标记山羊抗小鼠IgG和HRP标记山羊抗兔IgG(Canspec公司)，Western及IP细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理:动物随机分为自体血脑出血模型组和假手术组，两组再根据时间不同分为6、12、24和48 h组。脑出血组和假手术组每一时间点，分别进行脑含水量(brain water content，BWC)、免疫荧光和 Western blot检测。根据 Rynkowski等［4］的方法建立自体血脑出血动物模型，假手术组除不注射自体血外，其余操作同手术组。

1.2.2 干湿重法:检测BWC。

1.2.3 免疫荧光:常规灌注取出脑组织，－20℃低温切片机冠状面切片，片厚6 μm，裱片于APES处理过的玻片上。10%马血清封闭2 h，加 AQP4(1∶100)和 V1αR(1∶100)，4 ℃ 过 夜;加 FITC(1∶100)和 TRITC(1∶100)，50% 甘油封片，激光共聚焦扫描成像。使用Image-pro plus软件进行荧光强度值的分析。

1.2.4 Western blot:迅速取出患侧大脑，裂解液提取蛋白;BCA法测定蛋白浓度，10%Tris-Glycine SDS-PAGE凝胶电泳，湿转将蛋白条带转移至PVDF膜上，Western blot封闭液室温封闭1 h;加小鼠抗大鼠 AQP4(1∶800)和兔抗大鼠 V1αR(1∶500)，4 ℃ 过夜;加HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)和山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室温孵育2 h;DAB显色。使用Quantity One软件进行半定量分析，结果以目的蛋白和β-actin吸光度的比值表示。

1.3 统计学分析

实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS统计软件进行两独立样本的t检验和相关性分析。

2 结果

2.1 BWC的测定

脑出血组的BWC随着出血时间的延长而逐渐加重，至24～48 h时最明显，显著高于假手术组(P＜0.05)(表1)。

表1 大鼠脑出血后不同时间点脑含水量的变化Table 1 Changes of the BWC at the different times after ICH in rats(±s，%，n=5)

表1 大鼠脑出血后不同时间点脑含水量的变化Table 1 Changes of the BWC at the different times after ICH in rats(±s，%，n=5)

＊P ＜0.05 compared with sham group．

time(hours)sham group ICH group 6 77.32±0.73 79.09±0.34*12 76.99±0.42 80.59±0.74*24 77.38±0.83 82.41±0.39*48 77.68±0.78 83.65±0.51*

2.2 免疫荧光结果

在脑出血组，V1αR和AQP4共表达于软脑膜、脉络丛和血肿周围等处，尤其是24～48 h，两者在上述区域的表达明显增多;假手术组可见V1αR和AQP4在脉络丛有少量的表达，而在脑室周围未见表达。在6 h及其以后各时间点，V1αR和AQP4的表达量显著升高(P＜0.05)，FITC标记 AQP4，TRITC标记 V1αR(图 1，表 2)。

2.3 Western blot检测结果

在6 h及以后各时间点，V1αR和AQP4的表达量显著高于假手术组(P＜0.05)(图2，表3)。

2.4 V1αR和AQP4的表达及其与BWC的相关性分析

V1αR和AQP4在免疫荧光和Western blot的表达呈正相关(P＜0.05)，并与BWC呈正相关(P＜0.05)。

图1 大鼠脑出血后24 h V1αR和AQP4蛋白在脉络丛的共表达Fig 1 V1αR and AQP4 are co-expressed in the choroids plexus at 24 hours after ICH in rats(×800)

表2 大鼠脑出血后V1αR和AQP4在免疫荧光的表达变化Table 2 Changes of the V1αR and AQP4 expression in the immunofluorescence after ICH in rats(±s，n=5)

表2 大鼠脑出血后V1αR和AQP4在免疫荧光的表达变化Table 2 Changes of the V1αR and AQP4 expression in the immunofluorescence after ICH in rats(±s，n=5)

＊P ＜0.05 compared with sham group．

time(hours)sham group AQP4 6 ICH group V1αR AQP4 V1αR 14.19±0.41 13.95±0.39 17.37±0.64* 16.20±0.45*12 14.02±0.23 13.77±0.43 19.08±0.47* 19.67±0.32*24 14.06±0.29 13.91±0.44 22.22±0.46* 22.91±0.73*48 14.32±0.55 13.90±0.40 21.88±0.44* 23.16±0.67*

图2 Western blot检测大鼠脑出血后V1αR和AQP4蛋白的表达Fig 2 V1αR and AQP4 expression by Western blot after ICH in rats

3 讨论

AQP4是一种可介导细胞水分子转运的膜蛋白，在中枢神经系统主要位于星形胶质细胞的终足膜，对于脑组织内的水盐代谢具有重要作用。研究发现［5－7］，AQP4基因敲除的大鼠在由低钠血症、细菌性脑膜炎和脑缺血等所引起的细胞毒性脑水肿明显减轻;在脑肿瘤的模型中，AQP4基因敲除大鼠的神经缺失症状和颅内高压都较野生型大鼠为轻［8］。表明AQP4在脑水肿形成中具有重要作用。目前对AQP4表达调控机制的研究尚不充分。

表3 大鼠脑出血后V1αR和AQP4蛋白的表达Table 3 Western blot analysis of V1αR and AQP4 expression after ICH in rats(±s，n=5)

表3 大鼠脑出血后V1αR和AQP4蛋白的表达Table 3 Western blot analysis of V1αR and AQP4 expression after ICH in rats(±s，n=5)

＊P ＜0.05 compared with sham group．

time(hours)sham group AQP4 6 ICH group V1αR AQP4 V1αR 0.30±0.017 0.39±0.007 0.67±0.027* 0.61±0.015*12 0.29±0.011 0.37±0.017 0.73±0.025* 0.74±0.016*24 0.30±0.027 0.37±0.005 0.82±0.016* 0.84±0.021*48 0.30±0.013 0.39±0.023 0.84±0.021* 0.87±0.035*

AVP在体内主要由视上核和室旁核分泌，可调节体内水的重吸收和促肾上腺皮质激素(adrenocortico-tropic-hormone，ACTH)的释放，对于维持机体的内环境平衡有着重要作用。在体内AVP主要通过与其受体(VR)的结合而发挥作用，AVP的受体主要包括 V1和 V2。V1又分为 V1αR 和 V1βR，其中V1αR主要分布于中枢神经系统，尤其是额颞叶的星形胶质细胞［9］;而V1βR则主要分布于垂体，可调节ACTH的释放。V2主要分布于肾脏的远曲小管和集合管处，调节AQP2在肾脏内对水的重吸收［10］。在脑外伤后，脑组织中AVP和V1αR的浓度同时升高，AVP和V1αR的表达上调在外伤性脑水肿的形成中具有重要作用［11］。有关 AVP和V1αR在脑出血后的表达变化及其相关性尚未见报道。

本研究结果显示，在脑出血后6 h，可见V1αR和AQP4表达开始升高。二者的表达呈正相关，并与BWC呈正相关。提示AVP在出血性脑水肿形成中的作用是通过与V1αR的结合，导致细胞内的磷脂酶C(PLC)升高，继而引起二酰甘油(DAG)和肌醇1，4，5-三磷酸(InsP3)升高，而后者的升高引起细胞内Ca2+的升高，升高的Ca2+与DAG共同激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，PKC可通过 Ser180位点的磷酸化而引起AQP4的表达上调［12］，而后者的表达上调可介导星形胶质细胞对水通透性的增加，导致细胞外的水分向细胞内转运，从而引起脑水肿。

综上所述，脑出血后AQP4的异常升高是引起脑水肿的主要原因之一，而AQP4的升高主要由于V1αR的调节所导致。提示在临床出血性脑水肿的治疗过程中，可将V1αR作为治疗靶点，抑制V1αR的表达，以降低AQP4的表达，从而减轻脑水肿。

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Increased expression of V1αreceptor and AQP4 are related to rat brain edema after intracerebral hemorrhage

ZHANG Bo，SUN Shan-quan*，GAN Sheng-wei，ZHONG Xiao-yan，WU Xiu-yu，XU Jin，HUANG Juan

(Institute of Neuroscience，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

ObjectiveTo investigate the change of arginine-vasopressin V1αreceptor(V1αR)and aquaporin 4(AQP4)expression，to explore the mechanism of brain edema caused by intracerebral hemorrhage(ICH)．MethodsAutologous blood were injected into the caudate nucleus to develope ICH model．The changes of brain water content(BWC)were measured by wet and dry weight methods．The expression of V1αR and AQP4 were detected by immunofluorescence and Western blot after 6，12，24 and 48 h．ResultsThe expression of V1αR and AQP4 increased at 6h after ICH，and significantly increased the peak at 48 h(21.88±0.44 and 23.16±0.67)than the sham group(14.32±0.55 and 13.90 ±0.40)．V1αR and AQP4 expressions positively correlated with BWC(P ＜0.05)．ConclusionsThe increased expression of AQP4 mediated by V1αR plays an important role in the brain edema after ICH．

arginine-vasopressin;V1αreceptor;aquaporin 4;brain edema

R 741.02

A

1001-6325(2012)09-1021-05

2011－09－15

2011－12－29

国家自然科学基金(30470608)

*通信作者(corresponding author):sunsq2151@sohu．com