谷氨酸棒杆菌生产缬氨酸的代谢工程研究进展

王小元

（食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122）

谷氨酸棒杆菌生产缬氨酸的代谢工程研究进展

王小元

（食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122）

L－缬氨酸是人体必需的三种支链氨基酸之一，在生命代谢过程中起着非常重要的作用，因此被广泛应用于食品、医药及饲料等行业。目前，L－缬氨酸主要采用微生物发酵法生产，而谷氨酸棒杆菌是最常用的生产菌种。作者分析了谷氨酸棒杆菌中L－缬氨酸的生物合成途径和代谢调控，综述了对其进行代谢工程改造来提高L－缬氨酸产量的最新研究进展。

谷氨酸棒杆菌；L－缬氨酸生产；代谢工程；发酵；支链氨基酸

自从1957年Kinoshita等人［1］报道了谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）可以发酵生产谷氨酸，该菌已逐渐被用来发酵生产各种氨基酸，包括L－缬氨酸（L－valine）。L－缬氨酸是人体必需的一种支链氨基酸，具有多种生理功能，因此被广泛应用于食品、医药及饲料等行业。例如，L－缬氨酸在食品工业中用作营养强化剂和增香剂，在医药工业中用于制造复合氨基酸注射液和合成抗生素，在饲料行业中作为一种限制性氨基酸添加剂。由于其用途广泛，市场上L－缬氨酸总是处于供不应求局面，带动企业在L－缬氨酸产量及其生产成本等方面的良性竞争。目前，多数企业使用的L－缬氨酸生产菌来自于反复诱变，因而其遗传背景不明，很难通过进一步诱变来提高L－缬氨酸产量。近年来，随着谷氨酸棒杆菌全基因组测序及基因功能注释的完成［2］，代谢工程已被于构建L－缬氨酸生产菌，成为提高L－缬氨酸发酵生产水平的最有效方法。众所周知，优良的生产菌种是提高发酵产品产量和质量的保障。作者在分析谷氨酸棒杆菌中L－缬氨酸的生物合成途径和代谢调控机理的基础上，对其生产L－缬氨酸的代谢工程改造的研究进行综述。

1 谷氨酸棒杆菌中L－缬氨酸分子的生物合成途径

谷氨酸棒杆菌中L－缬氨酸的合成途径见图1。从丙酮酸出发，L－缬氨酸的合成先后涉及到乙酰羟酸合酶（AHAS）、乙酰羟酸同分异构酶（AHAIR）、二羟酸脱水酶（DHAD）和支链氨基酸转氨酶（TA）等［3－5］。首先，由两个基因ilv B和ilv N共同编码的AHAS将两分子的丙酮酸缩合成2－乙酰乳酸；其次，由基因ilvC编码的AHAIR将2－乙酰乳酸转化成双羟基异戊酸；再次，由基因ilv D编码的DHAD将双羟基异戊酸脱水形成2－酮异戊酸；最后，由基因ilv E编码的TA将2－酮异戊酸转化成L－缬氨酸；由pd x R和avt A编码的蛋白质在L－缬氨酸合成的最后一步也起到转氨酶的作用［6］。另外，TA也能催化L－亮氨酸和L－异亮氨酸合成途径的最后一步反应［5］。

谷氨酸棒杆菌中L－缬氨酸的合成途径还与其它一些主要代谢产物的合成途径相互交错，见图1。首先，L－缬氨酸合成的关键前体物质丙酮酸（Pyruvate）同时也被用于合成L－丙氨酸（L－alanine）、乙酰Co A（Acetyl Co A）和草酰乙酸（Oxaloacetate）。其次，L－缬氨酸的合成与L－异亮氨酸（L－isoleucine）的合成共享AHAS、AHAIR、DHAD和TA等4种酶，但是这些酶在不同的合成途径选用不同的底物。例如，AHAS以丙酮酸为底物合成L－缬氨酸，而用丙酮酸和2－酮丁酸二者为底物则合成L－异亮氨酸。AHAS对2－酮丁酸的亲和性远高于丙酮酸，因此在有2－酮丁酸存在时，丙酮酸被用来优先合成L－异亮氨酸，不利于 L－缬氨酸的积累［7］。最后，L－缬氨酸合成前体2－酮异戊酸的同时也被用于合成L－亮氨酸（L－leucine）和 D－泛酸（D－pantothenate）。针对这些特点，在优化谷氨酸棒杆菌生产L－缬氨酸时，不仅要加强L－缬氨酸的合成，还要考虑减弱其它相关代谢产物的合成，积累关键前体物质，将碳流导向L－缬氨酸的合成。

2 谷氨酸棒杆菌中L－缬氨酸合成相关的调控机制

微生物细胞内存在复杂的代谢网络，许多分子的合成都在DNA或蛋白质层次上受到严格调控，L－缬氨酸也不例外。L－缬氨酸合成途径中的一些关键酶受到产物抑制或转录弱化作用调控。胞内合成的L－缬氨酸的胞外分泌也受到调控。因此，要对L－缬氨酸生产菌进行理性的代谢工程优化，必须对其调控机制进行全面了解。

2.1 氨基酸产物对乙酰羟酸合酶的反馈抑制

L－缬氨酸反馈抑制的主要对象是其合成途径上的第一个关键酶AHAS。谷氨酸棒杆菌中AHAS全酶是四聚体，由两个相同的大亚基和两个相同的小亚基构成。大亚基为催化亚基，由ilv B基因编码；而小亚基为调节亚基，由ilv N基因编码。3种支链氨基酸均可以反馈抑制AHAS的小亚基［7－8］。L－缬 氨 酸、L－异 亮 氨 酸 和 L－亮 氨 酸 对AHAS的 半 抑 制 浓 度 分 别 为 0.9、3.1 和 6.0 mmol／L［3］。当浓度取5.0 mmol／L时，无论是单一的支链氨基酸，还是任意两种或三种支链氨基酸组合，对AHAS活性的抑制程度均不会超过57%［8］。这些数据说明3种支链氨基酸在AHAS小亚基上的结合位点是相同的，但它们与该结合位点的亲和性有差异。通过定点突变，对谷氨酸棒杆菌AHAS小亚基上20、21和22位的氨基酸进行替换，可获得一个不受任何支链氨基酸反馈抑制的突变体［8］。

2.2 编码乙酰羟酸合酶的基因转录弱化

在谷氨酸棒状杆菌染色体上，基因ilv B、ilv N和ilv C串联构成一个操纵元ilv BNC。Northern印迹实验证明ilv BNC操纵元可以转录3种长度分别为3.9、2.3、1.1 kb的 m RNA；它们分别对应于ilv BNC、ilv NC和ilvC3种DNA 片段［4］。如果将ilv B的上游序列删除，则只能获得长度分别为2.3 kb和1.1 kb的m RNA；如果将ilv N的上游序列删除，则只能获得长度为1.1 kb的 mRNA［4］。这些数据说明ilv BNC操纵子中含有3个启动子，因而基因ilvC可被转录3次，导致其表达效率在3个基因中最高。进一步研究发现，在ilv B上游292 bp处的一段DNA能表达一个短肽。这个短肽含有25个氨基酸，其中包括2个L－异亮氨酸、3个L－缬氨酸和2个L－亮氨酸，且短肽形成序列的后面存在能形成RNA茎环结构和转录终止子结构的序列［9］，说明这个短肽是对操纵元ilv BNC具有弱化调节作用的前导肽。前导肽翻译偶联的弱化作用对il－v BNC的转录调控进一步被Mobach等人用lacZ作为报告基因实验证实［9］。

图1 谷氨酸棒杆菌中L－缬氨酸的生物合成途径Fig.1 Biosynthesis of L－valine in C.glutamicum

2.3 L－缬氨酸胞外分泌的调控

如果胞内的L－缬氨酸不能被及时分泌到胞外，积累的L－缬氨酸就会抑制其生物合成途径中关键酶的活性，并弱化编码关键酶的基因转录，使L－缬氨酸的合成速度降低。胞内的L－缬氨酸必须通过膜转运酶Brn F和Brn E分泌到胞外［10］。全局基因表达分析发现，L－异亮氨酸的加入可以增加野生型谷氨酸棒杆菌中BrnF和BrnE的表达，但是对lrp敲除菌株没有影响。通过与lrp和brn F的启动子的转录融合表达分析，发现在培养基中添加3种支链氨基酸或L－甲硫氨酸均可以刺激brn FE的表达，但是这种刺激作用需要调控因子Lrp的存在［11］。芯片分析、带转变实验和DNAse足迹分析证明Lrp结合在lrp和brn F之间的DNA上［11］。

3 L－缬氨酸代谢工程菌研究进展

L－缬氨酸工业生产菌主要来自于传统诱变育种［12］，但目前代谢工程正在被用于谷氨酸棒杆菌的改良：利用已知的遗传学信息，对L－缬氨酸代谢网络进行系统分析，并采用基因工程技术改造谷氨酸棒杆菌以提高L－缬氨酸的产量［13－14］。近年来，一些适用于用于谷氨酸棒杆菌的表达载体已经被构建［15－17］。这些表达载体一般为大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的穿梭载体，含有较多的限制酶单酶切位点，有的是诱导性表达，有的是组成型表达。在谷氨酸棒杆菌中进行基因敲除的各种方法已经被建立［18－19］。由于同一启动子在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中的活性差别很大，所以针对谷氨酸棒杆菌中启动子的研究也已经展开［20－21］。目前，人们已经从阻止杂酸合成、积累关键前体物质、解除反馈抑制和优化启动子等方面入手构建出一些能高产L－缬氨酸的代谢工程菌，见图2。通过解析影响L－缬氨酸合成的关键因素，对谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组进行优化或在其中高效表达关键基因均可以大幅度地提高 L－缬氨酸的产量［8，15，22－24］。

图2 谷氨酸棒杆菌L－缬氨酸生产菌的代谢工程优化Fig.2 Metabolic engineering of L－valine production strains

3.1 切断旁支路并加强主干道碳流

如图1所示，L－缬氨酸的合成与L－异亮氨酸、L－亮氨酸和D－泛酸的合成交错在一起。因此，要提高L－缬氨酸的产量，首先要通过基因敲除阻止杂酸合成，然后通过高效表达来进一步加强L－缬氨酸合成。L－异亮氨酸和L－缬氨酸的合成途径共享的4个酶需要不同的底物。合成L－异亮氨酸最关键的前体是L－苏氨酸在ilv A编码的苏氨酸脱氨酶作用下产生的2－酮丁酸，所以可以通过敲除基因ilv A阻止L－异亮氨酸的合成。2－酮异戊酸是L－缬氨酸、L－亮氨酸和D－泛酸等3种酸的共同合成前体。由leu A编码的异丙基苹果酸合酶是L－亮氨酸合成途径中的第一个关键酶，通过敲除基因leu A可以阻止L－亮氨酸的合成。从2－酮异戊酸到泛酸的合成涉及到3个基因pan B、panC和pan E，其中两个关键基因panB和panC在染色体上位置相邻，通过敲除这两个基因可以阻止D－泛酸的合成。从丙酮酸出发合成L－缬氨酸需要5个基因ilv B、ilv N、ilv C、ilv D和ilv E。在基因组中，ilv B、ilv N和ilvC3个基因是串联的，ilv D与ilv B只相隔两个基因，而ilv E却远离其他基因。所以，基因ilv BNCD可以作为一个整体从基因组中扩增出来，通过载体高效表达来提高L－缬氨酸的产率。2002年，Radmacher等人通过缺失ilv A和pan BC基因并过量表达il－v BNCD基因构建了一个谷氨酸棒杆菌L－缬氨酸高产 工 程 菌 株 ATCC 13032Δilv AΔpan BCpJC1ilv BNCD［15］。该菌株利用4 g／d L葡萄糖摇瓶培养48 h能产生91.9 mmol／L（10.8 g／L）的L－缬氨酸。

3.2 积累关键前体和储备能源

L－缬氨酸合成的关键前体丙酮酸是细胞内非常重要的代谢产物，因此，降低丙酮酸的消耗也可以增加L－缬氨酸产量。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸的消耗方式主要有下列几种：一是通过ala T和avt A等基因编码的丙氨酸氨基转移酶（AA）生成L－丙氨酸［25］；二是通过aceE等基因编码的丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）直接合成乙酰－CoA，或通过pqo基因编码的丙酮酸／奎宁氧化还原酶合成乙酸，再进一步合成乙酰－CoA；三是通过丙氨酸羧化酶（PC）合成草酰乙酸。敲除这些相关基因，就可以通过积累丙酮酸而增加L－缬氨酸产量或通过减少杂酸含量而降低其生产成本。比如，在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032ΔilvAΔpanBCpJC1ilvBNCD［15］中进一步敲除alaT基因，L－缬氨酸的产量虽然增加不明显，但杂酸L－丙氨酸的含量降低了80%，最终导致下游分离纯化成本的降低［25］。通过敲除aceE基因并过表达ilv BNCE而构建的ATCC13032ΔaceEpJC4ilv BNCE分批发酵能产生210 mmol／L（24.6 g／L）的 L－缬氨酸［22］，说明丙酮酸的累积确实能增加L－缬氨酸产量。进一步敲除pqo基 因，得 到 的 菌 株 ATCC13032ΔaceEΔpqopJC4ilv BNCE能进一步提高L－缬氨酸的产量。由于培养丙酮酸脱氢酶缺陷型谷氨酸棒杆菌必须添加乙酸，这会影响葡萄糖的消耗，进而影响L－缬氨酸的合成［26］。Blombach等人［23］通过一系列实验发现用乙醇代替乙酸可以解决这个问题。添加乙醇 来 分 批 发 酵 ATCC13032ΔaceEΔpqopJC4ilv BNCE，葡萄糖的消耗速率是乙酸的6倍，66 h后积累了301 mmol／L （35.3 g／L）的 L－缬氨酸［23］。通过降低谷氨酸棒杆菌中H＋－ATPase的活性也可以积累丙酮酸［24］。将ATCC13032中染色体上atpG基因817位的T突变成C，导致其编码的H＋－ATPase的273位的Ser变成Pro，得到突变株A－1。在A－1中导入质粒p VKilv N53C摇瓶发酵72 h能产生95.7 mmol／L（11.2 g／L）的L－缬氨酸［24］。质粒p VKilv N53C含有ilv N53和il－vC两个基因，其中基因ilv N53编码的AHAS小亚基在C－端缺少53个氨基酸，导致AHAS具有抗L－缬氨酸反馈抑制的能力。

辅因子也会对L－缬氨酸的合成造成影响。在L－缬氨酸的合成途径中，消耗1 mol的葡萄糖，能产生2 mol NADH，同时消耗2 mol NADPH，才能合成1 mol L－缬氨酸。为了消除这种辅因子的影响，可以敲除编码磷酸葡萄糖异构酶的基因pgi，增加通过磷酸戊糖途径的碳流而生成更多的NADPH［27］。 这 样 获 得 的 菌 株的ATCC13032ΔaceEΔpqoΔpgipJC4ilv BNCE分 批 发 酵 能 产 生412 mmol／L（48.3 g／L）的L－缬氨酸［28］。最近，Hasegawa等人通过修饰AHAIR和取代TA的方式，将对辅因子NADPH的需求转变成对NADH的需求，也大幅度提高了L－缬氨酸的产量［29］。

3.3 解除反馈抑制和优化启动子活性

Elisakova等人［8］通过定点突变技术将染色体上ilv N基因编码的AHAS的小亚基的第20～22位氨基酸由原来的GlyIleIle突变为Asp AspPhe，导致AHAS完全解除了3种支链氨基酸的反馈抑制，在此基础上敲除了ilv A和pan B基因，并转入重组质粒p ECKAilv BNC，构建的工程菌株ilv NM13Δilv AΔpanBpECKAilv BNC能产生130 mmol／L（15.2 g／L）的 L－缬氨酸。以ilv NM13菌株为背景，利用染色体定点突变技术，Holakto等人［30］首先通过减弱ilv A和leu A基因的启动子活性，导致L－异亮氨酸和L－亮氨酸的合成速率下降，其次增强ilvD和ilvE基因的启动子活性，所得菌株ilv NM13ΔpanBP－ilv AM1CGP－ilv DM7P－ilv EM6在48 h内摇瓶发酵能产生136 mmol／L （15.9 g／L）的L－缬氨酸。这些数据说明通过谷氨酸棒杆菌染色体上的定点突变来提高L－缬氨酸的产量也是可行的。

4 展 望

理性设计是代谢工程育种策略的最大优势，这样构建的谷氨酸棒杆菌不仅能够最大限度地积累L－缬氨酸，而且能够最大限度的减少杂酸，简化后续分离提纯工艺，降低生产成本。目前，谷氨酸棒杆菌L－缬氨酸生产菌的理性设计研究主要围绕L－缬氨酸的生物合成途径，从以下几个方面展开：首先，在DNA层次上进行其编码基因的序列分析，通过定点突变消除转录弱化的调控和改变启动子的活性；其次，在蛋白质层次上解析这些酶的催化结构域和调节结构域，通过理性改造提高其催化活性和抗反馈抑制能力；最后，通过高效表达其编码基因将碳流最大限度地导向L－缬氨酸的合成。

L－缬氨酸的生物合成途径固然是优化改进谷氨酸棒杆菌的关键，但并不是全部。要构建最优的谷氨酸棒杆菌L－缬氨酸生产菌，还有很多其它的因素要考虑。未来代谢工程研究应针对谷氨酸棒杆菌细胞的整体代谢网络，结合转录组学、蛋白组学、代谢组学和计算机建模等现代生物技术［31］，全面分析影响L－缬氨酸生产的所有节点，提出全局性的菌种改进优化策略。

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Metabolic Engineering inCorynebacteriumglutamicumto Increase L－Valine Production

WANGXiao－yuan

（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

L－valine，one of the three branched－chain amino acids，is essential for human，and plays an important role in the metabolism of life，therefore，it is widely used in products of food，medicine and feed.L－valine is mainly produced by bacterial fermentation，and the most used bacterium is Corynebacterium glutamicum.In this article，the pathway and regulation of L－valine biosynthesis in C.glutamicum are analyzed and researches on metabolic engineering to increase L－valine production in C.glutamicum are reviewed.

Corynebacteriumglutamicum，L－valine production，metabolic engineering，fermentation，branched－chain amino acids

Q 933

A

1673－1689（2012）03－0225－07

2012－02－20

王小元（1965－），男，山西垣曲人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事工业微生物代谢工程方面的研究。E－mail：xiaoyuanwang＠hotmail.com