疏肝健脾方对乳腺癌组织淋巴管生成及Ang-2、nm23表达的影响

金培勇 李湘奇

(泰山医学院附属医院肿瘤科，山东 泰安 271000)

乳腺癌主要通过淋巴系统转移, 淋巴管生成是乳腺癌转移的机制之一，且淋巴结浸润程度是其关键的预后因素并决定了乳腺癌的进一步治疗。淋巴管生成由多个环节参与，受复杂的信号传导系统介导和调控。研究表明Tie2受体酪氨酸激酶的配体血管形成因子-2 (Ang2)，在形成淋巴管过程中起关键作用，维持毛细淋巴管的形态[1]。nm23基因是肿瘤转移抑制基因,对癌细胞的运动能力及转移潜能有明显的抑制作用, nm23基因蛋白的表达与腋淋巴结转移呈明显的负相关[2]。本研究采用免疫组化旨在检测乳腺癌治疗前后Ang2 、nm23表达的变化，探讨中药疏肝健脾方对乳腺癌淋巴转移的影响，探索复方中药联合化疗抑制乳腺癌的抗淋巴管生成的作用机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取泰山医学院附属医院2010年1月-2011年12月女性住院病人50例，采用巴德枪(BARD)组织活检，HE染色病理证实为乳腺癌。

1.2 试剂和药物

链霉卵白素-过氧化物酶(streptavidin-horseradish peroxidase,S-P)试剂盒(sp-9001)及浓缩型DAB显色试剂盒(ZLI-9031),D2-40单克隆抗体，鼠抗人nm23(ZM-0200)单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；鼠抗人Ang-2(bs-0677R)单克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；疏肝健脾方为泰山医学院附属医院乳腺、甲状腺外科科研处方，由柴胡、青皮、黄芪、茯苓、薏苡仁、莪术、枸杞子等组成,以上药物按照处方比例，购于泰山医学院附属医院中药房,经泰山医学院药学院鉴定,由药学院药剂学实验室制成口服液冷藏备用,规格: 1.8g(生药) /ml。

1.3 研究分组

50例病人来源于泰山医学院附属医院乳腺、甲状腺外科，年龄31～73岁，平均41.56±4.21岁，病程16d-5个月,平均56.38±11.65d;左侧29例,右侧21例;瘤体长径(T)≤2.0cm 24例,2.0cm5.0cm 5例;同侧腋窝无肿大淋巴结12例，有肿大淋巴结38例，其中1～3个淋巴结3例，3个以上淋巴结15例。按(UICC)国际TNM分期标准,Ⅰ期1例,Ⅱa期20例,Ⅱb期17例,Ⅲa期12例。按照抽信封法随机将分为2组, 疏肝健脾方组(实验组)30例，对照组20例。两组在病程、年龄及病情分期等方面经统计学处理,差异无显著性,均P>0.05,具有可比性。对照组给予CTF方案化疗(环磷酰胺500 mg/m2d1、8，吡柔比星50 mg/m2d1，5-FU500 mg/m2d1、8)，21d为1周期，共2周期，实验组在化疗的同时服用疏肝健脾方，20 ml/次,每天3次。

1.4 检测方法

两组50病人经巴德枪穿刺活检后按照分组给予CTF方案化疗及疏肝健脾方，活检标本常规石蜡包埋,制备4 μm厚连续切片，HE染色及免疫组化S-P法检测Ang-2、nm23蛋白的表达及D2-40标记的微淋巴管密度(LMVD)。化疗结束2周后行乳腺癌改良根治手术治疗，切除的乳腺组织标本经常规石蜡包埋,行组织学和 S-P免疫组化方法检测。S-P法步骤:石蜡切片脱蜡，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，抗原修复，3%H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，5～10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，滴加1∶100的一抗，37℃孵育，4℃过夜后PBS冲洗，滴加生物素标记二抗，37℃孵育10～30 min；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～20 min，PBS冲洗，滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育10～30 min，PBS冲洗，DAB剂显色，自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片。

1.5 结果判定

D2-40特异性地表达于淋巴管，参照Masakazu O等[3]的方法对乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织微淋巴管密度(LMVD)计数，把D2-40染色呈阳性着色的单个内皮细胞或内皮细胞簇分别计为1个阳性微淋巴管。乳腺癌组织先在低倍镜视野下分别选取肿瘤边缘(肿瘤浸润边缘区)和肿瘤中心区中脉管最丰富的区域(即"hot spot")，然后在200倍(0.74 mm2)视野下分别计数微淋巴管数目，每例计数3个视野，以其均值作为LMVD。

Ang-2、nm23均以肿瘤细胞胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。由两名病理专业医生分别对实验结果进行双盲法评估。每一切片随机选择3个视野,在显微镜(×400)下计数每个视野100个肿瘤细胞中阳性细胞的比例,取3个视野的平均百分数为判定结果。评分标准参照文献[4]适当修改：阳性细胞数≤5%为0分;>5%～25%为1分;>25%～50%为2分;51%～75%为3分;>75%为4分。染色强度:0分为无染色;1分为淡黄色;2分为黄色;3分为棕黄色。免疫组织化学结果根据染色阳性细胞数和染色强度分别评分,两者乘积0～1分为阴性(-);2～3分为阳性(+ ～ ++);4分以上为强阳性(+++)。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 疏肝健脾方对乳腺癌及淋巴管密度的抑制

实验组和对照组肿瘤体积和淋巴管密度统计差异无显著性(P>0.05),化疗后两组肿瘤体积均明显缩小，淋巴管密度明显减少，实验组与对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，说明CTF方案化疗结合疏肝健脾方口服对对乳腺癌生长及淋巴转移的抑制作用更明显。见表1。

表1 疏肝健脾方对乳腺癌生长及淋巴转移的抑制作用

注：组内化疗前后比较**P<0.01；组间化疗后比较▲P<0.05,▲▲P<0.01.

2.2 疏肝健脾方对乳腺癌组织Ang-2表达的影响

实验组和对照组乳腺癌组织中化疗前Ang-2阳性表达率分别为70.0%(21/30)、75.0%(15/20),组间比较无显著性差异(P>0.05)；化疗后Ang-2阳性表达率均显著明显降低，分别为36.67%(11/30)、65.0%(13/20)，两组比较差异有显著性(P<0. 05)，实验组化疗前后Ang-2阳性表达率均有显著性差异(P<0.01)。见表2，图1。

表2 疏肝健脾方对乳腺癌乳腺癌组织Ang-2表达的影响

注：组内化疗前后比较※※χ2=6.796，P=0.0097；组间化疗后比较△χ2=3.8595，P=0.0495。

2.3 疏肝健脾方对乳腺癌乳腺癌组织nm23蛋白的影响

实验组和对照组乳腺癌组织中化疗前nm-23阳性表达率分别为30.0%(9/30)、25.0%(5/20),组间比较无显著性差异(P>0.05)；化疗后nm-23阳性表达率显著升高，分别为56.7%(17/30)、70.0%(14/20)，两组比较差异有显著性(P<0.05)，实验组化疗前后nm-23阳性表达率有显著性差异(P<0.05)。见表3，图2。

表3 疏肝健脾方对乳腺癌乳腺癌组织nm23蛋白的影响

注：组内化疗前后比较※χ2=4.3439，P=0.0371；组间化疗后比较χ2=4.9123，P=0.0267。

实验组 对照组

实验组 对照组

3 讨 论

乳腺癌作为女性发病率及死亡率较高的恶性肿瘤是近年来研究的热点，尽管虽然在早期诊断和治疗方面取得了一些进展，但死亡率仍居高不下，乳腺癌的淋巴转移直接关系到乳腺癌的预后，淋巴管生成(lymphangiogenesis)在淋巴转移过程中起着至关重要的作用，是决定乳腺癌分期和选择治疗方案最关键的因素之一。Ang-2是重要的淋巴管生成调控因子， Ang家族与肿瘤淋巴管生成密切相关,研究表明乳腺肿瘤患者血浆中Ang-2表达水平与乳腺病变的良恶性有关,可能成为临床上判断乳腺肿瘤生物学行为的指标之一[5]。动物实验模型中发现Ang-2主要作用是介导淋巴管成熟，对于正常淋巴管的形成和稳定是必需的[6,7]。nm23基因来源于p53肿瘤抑癌基因的特殊区域，主要存在于胞浆和质上，对细胞的分化及癌基因的转化起作用，可抑制肿瘤转移发生。在研究中发现nm23基因蛋白在无腋淋巴结转移乳腺癌中的表达水平明显高于有腋淋巴结转移者，表nm23基因蛋白的表达与腋淋巴结转移、远处转移呈明显的负相关，并认为nm23基因蛋白表达减少可能提示乳腺癌进展、淋巴结转移及患者的预后较差[8]。

乳腺癌的转移是一个多因素、多步骤的复杂病理程，在此过程中，多种因素相互作用导致了癌细胞的转移，其中淋巴管生成是一个重要的环节。因此，干预乳腺癌转移的过程，抑制淋巴管生成尤为重要，这将有望成为乳腺癌治疗新的靶点。中医学将乳腺癌及其复发转移看作是全身性疾病的一个局部表现，治疗上主张全面调整人体机能，通过辨证论治以治癌。基于此，根据乳腺癌淋巴转移的传统病机理论和临床特点，以前期研究为基础进行延伸，采用疏肝健脾为主的治疗方法，结合中药药理化裁组方，联合CTF(环磷酰胺、吡柔比星、氟尿嘧啶)方案化疗，观察对乳腺癌淋巴转移的影响，结果疏肝健脾方能够通过干预VEGF-C、VEGFR-3的表达，抑制乳腺癌自发性转移模型裸鼠乳腺癌组织淋巴管生成，减少淋巴管密度，从而抑制乳腺癌的生长和转移[9,10]。为进一步验证复方中药对乳腺癌淋巴转移的抑制作用，重新优化疏肝健脾方为乳康饮(青皮、柴胡、莪术、薏苡仁、茯苓、黄芪)，实验研究表明乳康饮可显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-435S增殖，同时可以阻滞细胞周期于G2-M期，诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖关系[11]。

本研究表明，结果提示疏肝健脾方联合CTF方案化疗，能够降低乳腺癌组织Ang2蛋白的表达，提高nm-23蛋白的表达，相比CTF单一方案的作用更明显，说明疏肝健脾方能够通过降低Ang2蛋白的表达提高nm-23蛋白的表达，影响乳腺组织的淋巴管生成，抑制乳腺癌的淋巴转移。但是由于个体对新辅助化疗反应存在差异，复方中药的治疗操控性和重复性影响治疗效果，所以有待于进一步从更深层次进行研究，以明确复方中药对乳腺癌淋巴转移的作用机制。

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