VEGF-C治疗继发性肢体淋巴水肿的实验研究

侯传强 李宝江

(泰山医学院附属泰山医院乳腺外科，山东 泰安 271000)

肢体淋巴水肿是常见疑难病，国际淋巴学会估计，全世界大约4500万人患有肢体淋巴水肿。患肢常并发慢性炎症，皮肤及皮下组织增厚，胶原沉积，最终形成象皮肿,严重影响到病人工作生活，目前尚无确切疗效的治疗方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

实验用新西兰大白兔均购自山东省农业科学院实验兔场,共15只，平均2.5 kg，不限雌雄。采用右后肢作为实验肢体，左后肢作为对照。兔抗人FLT-4多克隆抗体购自Zymed 公司，兔抗人VEGF-C单克隆抗体购自武汉博士德公司，rhVEGF-C购自美国Biovision公司,鼠来源vWF多克隆抗体购自Santa Cruz 公司。

1.2动物模型制作 动物用2.5%的戊巴比妥钠麻醉,之后右后肢脱毛、消毒,于趾蹼皮内注射亚甲蓝注射液0.5 ml以标记淋巴管，大约10 min可显示股深部淋巴管,环形切除腹股沟以远3 cm宽的皮肤及皮下组织，清扫腹股沟淋巴结，切除部分蓝染的淋巴管并结扎其断端，皮肤内翻缝合于肌肉。术后3天使用60Co一次性给予2000 cGry剂量照射局部。4个月后获得持续性淋巴水肿的实验模型，共12只。

1.3实验动物分组及方法 淋巴水肿模型兔12只，随机分为2组，每组6只：实验组水肿局部注射VEGF-C，对照组注射生理盐水。VEGF-C稀释液制备：VEGF-C冻干粉(10 μg/支)用0.1%乙酸溶液稀释至6 ng/μl，小瓶分装，-80 ℃冰箱保存。注射时再次稀释至浓度为50 ng/ml。VEGF-C稀释液(每只动物注射10 ml)或生理盐水均匀注射到兔后肢手术创伤、射线照射区域、水肿软组织包括皮肤瘢痕，皮下组织及肌肉等组织，对照组注射生理盐水。

1.4 数据检测

1.4.1肢体水肿体积 即双侧肢体体积差值，用排水法检测，每周以手术近端切线为标准线，将肢体置入盛有一定量水的细长量筒中，使标准线以下没入水中，量筒显示值与原水量的差值即为肢体体积。

1.4.2微淋巴管计数 免疫组化法检测Flt-4，在高倍显微镜下计数染色的微淋巴管数目。每张染色玻片中选四周及中间5个高倍镜视野，取总数作为淋巴管计数。单个淋巴内皮细胞、淋巴内皮细胞簇、微小淋巴管均予以计数。

1.4.3Western blot检侧水肿部位组织中Flt-4、VEGF-C及vWF蛋白 一抗采用鼠来源vWF多克隆抗体、兔抗人VEGF-C单克隆抗体、兔抗人FLT-4多克隆抗体，二抗用羊抗兔二抗，DAB显色。

2 结 果

2.1肢体水肿体积的变化情况(见表1)。

表1 肢体水肿体积的变化情况

注：同组内不同时间比较，观察组均为P<0.05；对照组均为P>0.05。

2.2微淋巴管计数(见表2)。

表2 各组微淋巴管计数

注：同组不同时间比较，观察组均为P<0.01；对照组均为P<0.01。

2.3水肿部位组织中Flt-4、VEGF-C及vWF蛋白检测(见表3)

表3 Flt-4、VEGF-C及vWF蛋白的变化

3 讨 论

慢性肢体淋巴水肿常见于手术、烧伤、放射治疗后及寄生虫感染等。乳癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤之一，近年统计中国大城市中每10万人中就有30～60人患病，而乳腺癌根治性手术加放疗后患侧肢体淋巴水肿的发生率近年来仍在4.5%～30%[1，2]。医学上曾使用多种方法来治疗这种顽症，比如淋巴结移植[3]，淋巴管-静脉吻合[4]，各种保守治疗[5-6]等，但遗憾的是效果均不佳。

VEGF-C 是血管生长因子VEGF 家族中的一员，可与其受体Flt-4结合，特异性地促进新生淋巴管形成[7]。胚胎时期Flt-4主要表达在淋巴管从胚胎静脉发芽处，在成人则主要在淋巴管内皮细胞上表达。2002 年，Szuba A 等[8]发现VEGF-C 蛋白即可改善兔耳淋巴水肿模型淋巴系统的功能，促进淋巴管的增生。2006年Cheung L 等[9]发现人重组VEGF-C蛋白治疗鼠尾淋巴水肿模型可使水肿明显消退。2008年Jin da P[10]等用重组VEGF-C蛋白治疗术后继发性鼠尾淋巴水肿模型，结果表明可很好减轻症状。但是也有截然不同声音，有研究发现[11]鼠尾淋巴水肿的形成与VEGF-C过表达和淋巴管大量新生、紊乱有关，而MMP-9则起到减轻水肿的作用。

我们的研究表明，重组VEGF-C蛋白局部注射治疗肢体淋巴水肿是有效的。结果显示，治疗后1周、2周、4周两组肢体水肿体积比较，均为P<0.05，差别均有统计学意义；同组内不同时间比较，观察组均为P<0.05；对照组均为P>0.05，表明观察组肢体水肿体积在4周内随治疗时间延长逐渐减少，而对照组则无明显变化，显示重组VEGF-C蛋白局部注射可很好的减少肢体水肿体积，并且在4周内随治疗时间延长效果逐渐增强。

两组微淋巴管计数比较, 治疗后1周、2周、4周, 均为P<0.01，差别有明显统计学意义, 表明重组VEGF-C蛋白局部注射可促进水肿组织中微淋巴管形成；不同时间同组比较，观察组均为P<0.01，表明微淋巴管计数在4周内随治疗时间延长逐渐增多，说明了VEGF-C蛋白局部注射的疗效是持久的；而对照组微淋巴管计数在4周内也随治疗时间延长逐渐增多，结合肢体水肿体积无明显变化，分析考虑机体自我修复参与其中，但尚不足以纠正水肿。

Flt-4、VEGF-C 及vWF的变化，两组间比较，VEGF-C/β-actin为P<0.01， FLT-4/β-actin为P<0.01，提示VEGF-C蛋白局部注射后水肿组织中Flt-4、VEGF-C等保持较高水平，促进淋巴管内皮细胞增生，促进淋巴管网络系统重建，从而进一步减轻水肿；vWF /β-actin为P>0.05,提示VEGF-C蛋白局部注射不影响新生血管生成，对微循环系统无不良作用。

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