转MT工程菌的构建及其对重金属的抗性研究

仪慧兰，吕品，吴丽华

（山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006）

转MT工程菌的构建及其对重金属的抗性研究

仪慧兰，吕品，吴丽华

（山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006）

利用重叠延伸PCR技术克隆金属硫蛋白（MT）和绿色荧光蛋白（GFP）基因片段，并将两基因融合连接构建重组表达载体，采用氯化锂法转化毕赤酵母，获得工程菌株.荧光显微镜观察发现，工程菌在蓝光激发下发出绿色荧光，说明GFP基因被正确表达.在培养基中加入一定浓度的铜（1.0 mmol／L，1.5 mmol／L）、铬（150μmol／L，200μmol／L）、镉（120μmol／L，140μmol／L）、砷（40μmol／L，60μmol／L）化合物后，对照菌生长抑制，转基因菌株长势明显好于对照菌，表现出对金属离子的耐受性，说明工程菌过表达MT能够增强宿主对重金属离子的耐受性，提高菌株耐污能力，在微生物法净化重金属废水中具有一定优势.

金属硫蛋白;绿色荧光蛋白;重叠PCR;重金属抗性

近年来，随着城市化进程的加快和工业的迅猛发展，大量未经处理的工业废水、城市垃圾和生活污水不断排入环境中，使水体中的重金属含量急剧升高.我国各大江河湖库均受到不同程度的重金属污染，底质污染率高达80.1%，而且已经影响到水体的质量［1］.通过饮用重金属超标水，或食用重金属超标的蔬菜和粮食等，使人体摄入过量重金属元素，机体代谢受到干扰，出现各种急性和慢性疾病.调查显示，全球饮用水中约80%无法达到卫生标准，在所有已知的人类疾病中70%～80%与水污染有关［2］.因此，对重金属污染的治理显得尤为重要.

金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是一类富含半胱氨酸（Cys）的蛋白质，其Cys的巯基与重金属离子具有极强的结合力［3］，能结合重金属离子形成无毒的配合物，具有解除重金属毒性的功能.采用基因工程方法构建MT高效表达载体转化生物，可以获得对重金属离子具有较高耐受性和结合力的工程菌株和工程植物［4－7］，有望用于治理重金属污染［4］.本文采用重叠延伸PCR技术［8－9］，将金属硫蛋白和绿色荧光蛋白基因（Green Fluorescent Protein，GFP）进行拼接，获得了MT-GFP融合基因，构建重组表达载体转化毕赤酵母，以期筛选和获得可用于重金属污染治理的微生物菌株.

1 材料和方法

1.1 菌株和质粒

大肠杆菌（E.coli）DH5α，毕赤酵母（P.pastoris）GS115，酵母重组载体p CUP9K，重组质粒p YX112-GFP，由本实验室保存;重组质粒pGEM-T-As MT2b由中国科学院植物研究所张海燕博士惠赠.

1.2 培养基

LB培养基：每升含10 g蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl，p H 7.0.抗性筛选时用100 mg／L氨苄青霉素（Amp）.大肠杆菌培养温度为37℃，液体培养转速为250 r／min.

YPD培养基：每升含20 g蛋白胨、10 g酵母粉、20 g葡萄糖.MD筛选平板：每升含13.4 g酵母基本氮源、0.000 4 g生物素、20 g葡萄糖、15 g琼脂粉.酵母培养温度为30℃，液体培养转速为200 r／min.

1.3 引物设计与合成

采用重叠延伸PCR法，根据金属硫蛋白［10］和绿色荧光蛋白基因序列及载体p CUP9K上的多克隆位点，设计并合成特异性引物（表1），使AsMt2b下游引物P2和GFP上游引物P3的32个碱基（下划线部分）完全互补，在引物P1和P4中分别引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点.引物由上海生物工程有限公司合成.

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR amplification

1.4 重叠延伸PCR与重组载体的构建

以质粒p GEM-T-As MT2b和p YX112-GFP为模板，分别用引物P1／P2和P3／P4进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用DNA凝胶回收试剂盒割胶回收.以回收的AsMT2b和GFP序列为模板，调整两者摩尔浓度比为1∶1，采用重叠延伸PCR方法，用AsMT2b上游引物P1和GFP下游引物P4进行PCR扩增，电泳检测并割胶回收扩增产物.

用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切PCR产物和重组载体p CUP9K，T4连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5α细胞，菌液涂布于含Amp的LB平板筛选阳性克隆.提取阳性克隆中的质粒，用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切验证，将构建好的重组载体称为p CUP9K-As MT2b-GFP.重组表达载体用BglⅡ单酶切线性化，回收大的目的片段，用于转化毕赤酵母GS115.

1.5 酵母感受态细胞的制备与转化

毕赤酵母GS115接种于YPD液体中，培养至生长对数期（约108个细胞／m L）.取4 m L菌悬液12 000 r／min离心30 s收集细胞，加无菌水洗涤，12 000 r／min离心10 min后弃上清.加入0.1 mol／L的LiCl溶液重悬细胞，12 000 r／min离心15 s，吸去LiCl.加入30μL 0.1 mol／L LiCl溶液重悬细胞备用.

将鲑鱼精单链DNA（2 mg／m L）沸水浴5 min，快速放于冰水中冷却.取酵母感受态细胞12 000 r／min离心15 s，吸除LiCl.每个转化样品，按顺序加入以下试剂：50%PEG 3350 144μL，1 mol·L－1LiCl 22μL，2 mg／m L鲑鱼精单链DNA 15μL，线性化载体30μL.剧烈震荡至细胞沉淀完全混匀，30℃孵育30 min，42℃水浴热激20－25 min.6 000－8 000 r／min离心1 min，收集细胞，加300μL无菌水悬浮细胞.将菌液涂布于MD筛选平板，30℃培养2－4 d，直至长出酵母单菌落.挑取单菌落接种于YPD液体中过夜培养，提取基因组DNA，利用引物P1／P4进行PCR验证，电泳检测扩增产物.

1.6 工程菌的荧光检测

从平板上挑取工程菌单菌落，于YPD液体中培养过夜.取少量菌悬液在BX51型荧光显微镜（Olympus）下观察，用蓝光（波长460～480 nm）照射，观察菌体有无荧光产生，并用DP72型显微镜数码相机拍照.

1.7 工程菌对重金属的抗性

分别制备含有铜（硫酸铜）、铬（重铬酸钾）、镉（氯化镉）、砷（亚砷酸钠）化合物的YPD平板，每种重金属设置2个浓度梯度.挑取工程菌单菌落于YPD液体中活化后转接于YPD液体中培养至生长对数期.离心收集菌体，用无菌水清洗2次后重悬，测OD600nm.将菌液以10倍梯度逐级稀释，用移液器吸取不同浓度的菌液5μL，依次点样于含重金属的平板.以未转基因的酵母和转入空载体pCUP9K的酵母作为对照菌株，设置不添加重金属的相同处理为对照，观察和分析酵母的生长状况.

2 结果与分析

2.1 重组表达载体及工程菌的验证

电泳检测引物P1／P2和P3／P4的PCR扩增产物，可见大小约为243 bp（图1A，P397）和717 bp（图1B）的单一条带，与理论值一致，分别为AsMT2b和GFP基因片段.电泳检测重叠延伸PCR的扩增产物，可见约960 bp的单一条带（图1C），表明AsMT2b和GFP基因已经融合连接.从阳性克隆中提取的质粒用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，电泳检测可见分子量为960 bp的As MT2b-GFP融合基因片段（图1D），表明重组表达载体pCUP9K-As MT2b-GFP构建成功.将重组载体转化毕赤酵母GS115，提取转化子的基因组DNA作模板，用引物P1／P4进行PCR扩增，获得AsMT2b-GFP融合基因片段，表明工程菌株构建完成.

图1 琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 DNA analysis by agarose gel electrophoresis（A）M：150 bp marker 1：As MT2b基因扩增产物 （B）M：150 bp marker 1：GFP基因扩增产物（C）M：150 bp marker 1：重叠PCR扩增产物（D）M：10 000 bp marker 1：EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pCUP9K-As MT2b-GFP产物

2.2 工程菌的荧光特征

荧光显微镜下用波长460－480 nm的蓝光激发，可以观察到工程菌菌体发出的绿色荧光（图2），其荧光位置与普光下菌细胞位置一一对应，表明As MT2b-GFP融合蛋白在工程菌株中获得正确表达.

图2 工程菌的荧光显微镜观察（物镜20×） （A）普通光学显微镜 （B）荧光显微镜Fig.2 Imaging of green fluorescence proteins engineered to yeast cells（A）under a light microscope （B）under a fluorecence microscope

2.3 工程菌对重金属的耐受性

检测转AsMT2b基因的工程菌株对4种重金属（铜、铬、镉、砷）的抗性.结果显示，在未添加重金属的平板上，工程菌的生长状况与对照菌大致相同;在添加重金属的平板上，3个酵母菌株的生长均受到抑制，高浓度组抑制作用较强，转MT工程菌生长明显好于两个对照菌.在含低浓度铜（1.0 mmol／L）、铬（150μmol／L）、镉（120μmol／L）的平板上，对照菌虽受抑制但可以生长分裂，工程菌生长无明显抑制，在含高浓度铜（1.5 mmol／L）、铬（200μmol／L）、镉（120μmol／L）的平板上，对照菌无可见菌落形成，即细胞生长分裂完全抑制，而工程菌能够生长分裂形成菌落和菌斑.在所检测的浓度范围内，工程菌对铜、铬、镉的耐受性显著增强，对砷的耐受性影响较小.砷浓度60μmol／L时工程菌比对照菌长势略好，砷浓度40μmol／L时两者差异不明显.这表明，工程菌过表达金属硫蛋白As MT2b基因能够增强宿主对铜、铬、镉离子的耐受性，使菌体的耐污性明显提高.

图3 工程菌株对不同重金属的耐受性Fig.3 Tolerance of engineered yeast strain to copper，cadmium，chromium and arsenic

3 结论

重叠延伸PCR技术使用具有互补末端的引物，使两个目的基因形成重叠链，在扩增反应中通过重叠链的延伸，将两个目的基因融合连接起来，能够在体外进行基因重组，而且避免不必要的酶切和连接，重叠PCR技术的关键在于重叠互补引物的设计［11］.利用本文设计的特异性引物，成功扩增出金属硫蛋白（MT）和绿色荧光蛋白（GFP）基因片段，并将其连接获得MT-GFP融合基因，构建重组表达载体p CUP9KAs MT2b-GFP，转化毕赤酵母GS115获得工程菌株.

用荧光显微镜观察到工程菌中GFP的特异性绿色荧光，证实了MT-GFP融合基因在工程菌株中的正确表达.通过平板培养检测转金属硫蛋白AsMT2b基因的工程菌株对4种重金属（铜、铬、镉、砷）的抗性，发现工程菌对铜、铬、镉离子的抗性明显增强，这说明工程菌过表达AsMT2b基因能够增强宿主对铜、铬、镉离子的耐受性，使菌体耐污能力明显提高.用微生物法处理重金属废水时，因废水中往往含有多种有害成分，对微生物细胞具有毒性作用，耐污性较强的菌株更适于对废水的净化处理，因此，本文构建的工程菌用于微生物法净化重金属废水具有一定的优势.

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Engineered Yeast Cells Displaying Metallothionein Enhance Self Tolerance to Environmental Heavy Metals

YI Hui-lan，LU..Pin，WU Li-hua

（SchoolofLifeScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

The metallothionein（MT）gene and green fluorescent protein（GFP）gene were cloned，modified and fused by gene splicing by overlap extension PCR technique，and then one recombinant expression vector was constructed and transformed intoP.pastoris.The engineered yeast cells could emit the green fluorescence under a fluorescence microscope，indicating the correct expression ofMT-GFPfusion gene in yeast cells.On YPD medium containing respectively copper（1.0 mmol／L，1.5 mmol／L），cadmium （120μmol／L，140μmol／L），chromium （150μmol／L，200μmol／L）and arsenic（40μmol／L，60μmol／L）ions，the engineered yeast strain cells could grow and divide to form some colonies，but the control strains without exogenousMTgene can not grow normally to form a clear colony，especially after exposed to higher concentrations of the metals.The results showed that transgenic yeast cells expressed the metallothionein gene increased the self tolerance to environmental heavy metals，which might be a useful material for wastewater treatment.

metallothionein;green fluorescent protein;overlap extension PCR;heavy metal tolerance

0253-2395（2012）02-0395-05

Q785

A

2012-01- 13;

2012-02-27

山西省工业攻关项目（20080321084）;太原市明星计划项目（08121012）

仪慧兰（1963－），女，山西新绛人，博士，教授，主要研究方向为环境生物学.E-mail：yihuilan＠yahoo.com.cn